荧光分光光度法课件.pptxVIP

荧光分光光度法;简介;1.与UV异同点

1)构造与UV很相似.

属于分光光度法,光源.单色器等

2)组件的布置稍有不同

荧光采用激发光和发射光

成直角的直角光路.,

3)原理也不一样.这在后面介绍

;2.荧光分析法主要应用范围

1）生物技术的分析,免疫技术的分析,如DNA、抗体、抗原等;

2）痕量元素的分析，如70多种无机元素；

3）间接测定众多的有机物，包括药物。

;荧光分析一般分为三种：;3.优势

1）灵敏度高：比UV高2~~3个数量级.

2）信息多:激发分光光谱（信息同于UV）、发射光光谱的发光强度、发光寿命、量子效率、荧光偏振等多种信息,定性更好;

;3）工作曲线的线性范围宽（定量更准）应用范围也广微量元素的分析、医药、环境,石油工业等能直接或间接分析众多的有机物

4）专一性强：许多物质的测定采用间接法.

伯乐公司的LabeledDNA的荧光标记物Labelingkits.;荧光发光的原理:;2.发射过程

当激发态在返回基态时，伴有光子的辐射称为发光过程，又称发射过程。

荧光和磷光均为此种光致发光过程。(又称冷光)

实际从激发态回到基态过程充满竞争。

;(jablonskii)杰不朗斯基的图解;S:基态S*激发态

S0、基态F:荧光P:磷光

S1:为单一态的低能级

T:三重态Three

VR:振动驰豫VibratoryRelaxation

内转换：InterCrossing

系内转换：

InterSystemCrossing

;1）单一态

激发过程中,当S=0时为单一态.

①S原子光谱谱项符号量子数S的2S+1表示谱项的多重性，

②自旋量子数ms（电子）

可取值只有±1/2（即顺旋或反旋）

③自旋的两种状态:

当自旋配对时.S=0，不配对则S=1

;2）三重态.S=1则2S+1=3

A.跃迁时通常自旋不变，即单一态?单一态；

B.激发过程中自旋方向被倒转或改变了，则为三重态；

C.三重态的能量比相应的单一态高，但能量差要低.应该到三重态.

D.单一态向三重态的跃迁属于跃迁禁戒，

跃迁几率为单重态向单一态的10-6。

;3）振动驰豫VibratoryRelaxation

溶质分子向溶剂转移过剩的振动能

吸收跃迁所需的时间很短(10-15S)，分子具有的几何形状及所处的环境还来不及改变，可能发生两种变化

①直接从激发回到基态（发射光子）10-9~10-7S

②发射辐射前改变振动能级.

10-11~10-13S

;溶质分子向溶剂转移过剩的振动能而发生的分子驰豫是相当快的，在10-11~10-13S就能无辐射而降落到受激态最低振动能级，因为快，所以溶液中分子快速振动驰豫后，光子发射总是由受激态的最低振动能级发生的。

;4）荧光Fluorescence

分子处于受激态的最低振动能级后，变化之一发射光子回到基态---荧光

波长：荧光光谱吸收光谱

量子效率φ:受激单一态的寿命在10-9~10-7，若无其他竞争，则全部受激分子发射荧光，φ=1；

实际有竞争，0---1之间

;5）内转换:

(IC)InterCrossing

A.全部激发能转变为热.而本身回到基态,即受激单一态与基态间转换，为低效率过程;

B.受激单一态间(能量不同的单一态)的内转换则为多得多的几率过程.(主要）

;6）系内转换(ISC)

ISC:单一态与三重态间的转换

对三重态布居粒子的高效途径是与回到基态发生争夺。

状态的改变是禁戒的，但发射光子回到基态需要10-9--10-7S,而内交换只需10-13S,比发射光子的时间更短.所以系内交换可与荧光发射进行竞争。

;一般来说系内交换的几率愈大小取决于：

最低能量受激单一态与三重态的能量间隔愈小;

最低能量受激单一态的寿命愈长,(即发射光子愈慢)几率愈大。

;7）磷光phosphorescence

受激三重态上的粒子回到单一态基态的形式是被禁戒的.但还是可发生的

原因：寿命很长(10-3S)及ΔE小.

总结:原理2步

①激发λex,

②发射λem,发时竞争

;(jablonskii)杰不朗斯基的图解;;三.量子效率:(在定量计算先讨论Ф);Ф=

Kf:荧光发生过程

Kx:系内交联的ISC过程

Kc:第一受激单一态的无辐射能量损失过程或讲将其激发能转变为热能过程的IC过程。

KfKc和KxФf-?1，

Kc或KxKf则Фf-?0无荧光

Kf大小影响Фf的大小

;3.影响k的因素:

1）Kf为最低受激单一态与基态之间跃迁几率大小的量