甲基化分析中的DNA样品制备方法 沉淀法.pdf

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甲基化分析中的DNA样品制备方法沉淀法

1范围

本标准规定了组织和培养的细胞等生物样本中DNA甲基化分析的样品制备方法。

本标准适用于从组织和培养的细胞中提取DNA用于甲基化分析。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

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文件。

国家标准或国际标准

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

DNA甲基化（DNAmethylation）是基因表达调控的一种重要机制，是在不改变DNA序列的前提下

对基因组DNA进行甲基化修饰。

4原理

DNA甲基化检测可以采用的方法比较多，PCR法是比较是比较简单易行的方法之一。原理是利用亚

硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶在转化过程中保持不变。

转化后，DNA的甲基化情况可以通过PCR扩增或DNA测序来判定。

在法检测中的纯化最常用的的方法是沉淀法。除上述比较经典的沉淀法以还有有物理的方

PCRDNA

法：如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式如酶法，

根据核酸分离纯化方式的不同有硅质材料、阴离子交换树脂等。

沉淀法是在去污剂的作用下将细胞裂解，然后在细胞裂解也中加入加速细胞破碎，再加入酒精

SDS

将沉淀，采用蛋白酶和氯仿异戊醇去除蛋白质，得到纯化的。

DNAK/DNA

5仪器设备

5.1高速台式离心机，

5.2高速冷冻离心机，

5.3紫外可见分光光度计，

5.4紫外及化学发光凝胶成像仪。

5.5超纯水系统

可调移液器，（μμμ）

5.60.5~10l,10~200l,100~1000l,

6试剂和材料

6.1.细胞裂解液（10mMTris-HClpH8.0，0.01MEDTA，0.5%SDS），

纯净水，电阻率Ω（分子生物学级）

6.2.ddHO18

2

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6.3.乙醇（75%和100%）（分子生物学级），

6.4.苯酚（分子生物学级），

6.5氯仿（分子生物学级）。

7样品

样品来源：甲基化检测的样品可以来源于血液、冷冻组织样本或石蜡组织块。用于甲基化分析的

样品应采用冷冻和其他适当的方法保存良好以防样品降解。

样品处理：采用细胞裂解液或其他适当的试剂提取细胞和组织中的DNA，进一步将DNA与蛋白

质和其他杂质等分离并采用苯酚-氯仿或其他适当的方法如沉淀法等纯化DNA，纯化后的DNA经95%

或100%酒精再次冲洗沉淀，获得的DNA沉淀采用纯净水再次溶解备用。

8DNA样品制备

试剂配制

细胞裂解液：10mMTris-HClpH8.0，0.01MEDTA，0.5%SDS。

9DNA样品分析

DNA纯度检测一半采用分光光度法在波长260nm对其进行检测，同时可以通过测定DNA样品在

260/280（A260/A280）的紫外吸收值估算DNA的纯度，其比值在1.8为纯度较好，其比值高于2.0预示

着样品中有RNA没有除尽。同时也可以采用凝胶电泳的方法检测DNA的纯度，并检测样品中是否有RNA

存在。