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《NADH氧化酶活力的测定分光光度法》编制说明
一、工作简况
(一)任务来源
NADH氧化酶(NOX)(E.C.1.6.--)是一类重要的氧化还原酶,可催化还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化,将分子氧还原至过氧化氢或水。NADH氧化酶广泛分布于各种具有不同亲源关系的物种当中,如人类、脊椎动物、植物、细菌以及古细菌中,对维持生物的正常生理功能有重要作用。NADH氧化酶在工业和医学领域具有重要的应用价值。在食品工业中,NADH氧化酶可通过减少导致腐败的微生物的生长来提高食品的保质期,也可用于奶酪和其他乳制品的生产,改善最终产品的风味和质地。在化学工业中,NADH氧化酶可作为氧化型辅酶再生的工具,用于手性醇、胺的生产。在医学领域,NADH氧化酶是一种潜在的抗菌剂,另外其具有抗氧化特性,在预防和治疗心血管疾病和癌症方面具有潜力。
NADH氧化酶的酶活力是其质量的重要指标之一,鉴于目前我国并无统一的NADH氧化酶活力测定的方法标准,产品的实际酶活力和包装标识的酶活力是否一致还缺乏相关的标准进行规范约束和验证,因此研制NADH氧化酶活力的测定标准将为NADH氧化酶的生产、流通及监管提供依据,促进我国NADH氧化酶相关的食品工业、化学工业和医学的健康发展,具有非常重要的现实意义。根据行业的现实需
求,中国标准化研究院于2024年3月提出《NADH氧化酶活力的测定分光光度法》团体标准计划,并牵头承担标准起草任务。
2024年5月,经中国产学研合作促进会组织专家通过批准立项,立项名称为《NADH氧化酶活力的测定分光光度法》。
(二)标准的起草单位及起草人
本标准起草单位:
本标准主要起草人:
(三)主要工作过程
1.预阶段
2024年3月至2024年5月标准起草单位组织相关技术人员对《NADH氧化酶活力的测定分光光度法》标准项目进行了预研,对NADH氧化酶的活力测定条件进行了摸索,初步确立了NADH氧化酶活力的测定方法。标准起草组向中国产学研合作促进会提交了标准建议书与标准草案,进行申报立项。
2.立项阶段
2024年5月,中国产学研合作促进会正式通过本团体标准的立项。
3.起草阶段
针对该标准项目,正式成立了标准起草工作小组,明确了任务要求,安排了工作进度,根据单位参与的人员的专业、技能、人数将任务合理分配。依据GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》对标准草案进一步完善的同时,开展技术指标的实验验证工作。
在此期间,通过线上和线下会议结合的形式开展了3次工作会议。会议就标准制定的相关问题进行了协商与研究,并对标准的框架及内容进行了认真研究和讨论。由此形成了最终的《NADH氧化酶活力的测定分光光度法》团体标准征求意见稿和编制说明。
二、确定标准主要技术内容
(一)标准编制原则
坚持严要求、适宜性与可操作性相结合的原则。严要求即标准的编制严格遵循GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》及相关法规的要求进行;适宜性既要充分考虑到本行业的发展现状与特点,又要有一个适宜的范围与程度,从而提高标准贯彻实施的可操作性。
(二)本标准主要技术内容
1.主体内容
本标准的主体内容包括:范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、试剂、仪器设备、试样制备和试验步骤、试验数据处理以及精密度。
2.范围
本文件描述了测定NADH氧化酶活力的分光光度法。本文件适用于生化试剂、工业酶制剂中NADH氧化酶活力的测定。
3.规范性引用文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。
4.术语和定义
对NADH氧化酶活力单位进行了定义,是在30℃、pH7.0的条件下,每分钟产生1μmolNADH所需的酶量为一个酶活力单位,单位为U。
5.原理
NADH氧化酶催化底物NADH的氧化生成NAD+,NAD+在340nm下无吸收,而NADH有吸收,其ε340=6.22mM-1cm-1,通过监测340nm下吸光度的变化来测定NADH的消耗,计算酶活力。
6.NADH氧化酶活力测定方法的确立
由于酶活会受到反应底物浓度、pH、缓冲液以及温度的影响,因此选取不同底物浓度、不同pH、不同缓冲液、不同温度条件对NADH氧化酶的活力进行测定,以确定酶的活力测定的几项重要参数。
6.1反应底物浓度的确定
在反应底物未饱和的条件下,酶活随着底物浓度的增加而增加,当底物浓度增加到一定程度后,酶活不再变化或者出现底物抑制作用而降低。NADH氧化酶在不同NADH浓度下的活性如图1所示。当NADH的浓度高于0.1mM时,NADH氧化酶的活
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