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流式细胞仪荧光补偿

在流式细胞仪分析中用到的“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程,

如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。荧光补偿过程从原理上来说相对

简单，但实际上涉及许多精细、敏感的方面从而使在实践操作相当复杂。关键词:

荧光补偿细胞

在流式细胞仪分析中用到的“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程,

如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。荧光补偿过程从原理上来说相对

简单，但实际上涉及许多精细、敏感的方面从而使在实践操作相当复杂。非常不

幸，荧光补偿操作可能是在流式操作中的数据采集和分析等步骤中最少被了解和掌

握的内容，可能是因为在介绍它时经常要用到线性代数来计算，并且还要求了解

它的产生原理。然而，正确的荧光补偿对于许多流式分析来说绝对是至关重要的，

特别是对现常见的多抗原荧光表达强度分析。因为荧光补偿常被误解、误用并被

许多不正确的观念所包围，许多实验室的荧光补偿设置都不正确。本章的一个部分

将剖析有关补偿的一些疑惑问题。

图1显示在设置荧光补偿中常犯错误。本章将致力于从以下方面阐述流式细胞

仪荧光补偿问题:为什么它是必须的，它是如何通过硬件或软件来完成的，荧光补

偿是如何时影响数据视觉效果的，最后是如何设计一个最佳的实验来获得一个正确

的荧光补偿。通过完整地阅读本章节，读者将学会为实验正确地设置荧光补偿并

在出版物中识别出补偿设置不当的数据，并能够明白这些错误是如何影响分析结果

的。尽管全面的阐述荧光补偿不可避免地要涉及到一些线性代数的问题，但正确

掌握荧光补偿并不一定要求要掌握它;在这两部分内容中的问题可根据你的意愿撇

去或跳过。

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大部分的流式用户不能正确回答图1中的三个问题。对于问题1的正确答案是

“样本2”。对于问题2，答案中十字门虚线的位置就不正确。最后，第三个问题

的正确答案是:“不可能决定哪个图形中的荧光补偿是正确的”，因此其中没有哪

个可以说中正确的。

如果一个正确的荧光补偿对于流式数据分析这么重要，并且又这么少的人知道

如何正确地去设置它，而为什么到目前为止流式细胞仪的分析结果还都不错。对于

此问题的简单答案是绝大多数类型的数据分析并不绝对需要正确的荧光补偿。此问

题的另一个答案是不正确的荧光补偿在双色或三色分析中显得并不十分重要。然而

随着五色分在大多数实验室中开展，如果这些个问题持续下去将会导致实验失败。

来说，思考在图1中的图谱，可以发现即使荧光补偿并不正确但仍可以正

确计算细胞亚群的比例。然而计算这些细胞亚群的比例必须以单染的样本为对照，

而不是以各个荧光的同型对照染色为对照～正确的设门应该是以CD3FITC和

PEisotype染色样本为基础。

图1中还显示了荧光补偿在正确检测抗原荧光表达强度中重要影响。在此，任

何不正确的荧光渗漏都会误导分析结果。此外，正确的荧光补偿在将弱阳性群体

与阴性群体正确区分中有极其重要的作用;荧光补偿不足会导致弱阳性群体是假阳

性颗粒增多，而过度补偿则会丢失弱阳性群体而导致假阴性。

注意在补偿调节不当的数据中正确计算的亚群数量的现象在三色或更多荧光分

析实验中可能不成立。在本章的结尾将给出一个计算失败的这种案例。此外还讨

论了如何为分析数据设计一个正确的染色对照(甚至当荧光补偿设置并不正确时)。

这些称为“缺一型荧光染色”或FMO对照是进行正确多色荧光分析的前提保证。

荧光补偿基础

荧光补偿是指修正荧光光学信号在探测器之间相互渗漏并被数字化检测的过

程。