宁夏马铃薯Y病毒(PVY)外壳蛋白基因分子变异分析.docx

?

?

宁夏马铃薯Y病毒（PVY）外壳蛋白基因分子变异分析

?

?

陈晓军樊云芳王敬东等

摘要：马铃薯（Solanumtuberosum）Y病毒（PotatovirusY，PVY）是危害我国马铃薯的主要病毒之一。利用马铃薯Y病毒通用ELISA试剂盒确定所携带Y病毒的试验材料，设计了特异性引物通过反转录PCR获得PVYCP基因序列，通过克隆PVY衣壳蛋白基因（Coatprotein，CP）序列分析其进化与变异类型。结果表明，分离得到11株病毒，依据其CP序列特性分为4类；宁夏地区主要流行的病毒类型为PVYO进化分枝，同时也可能出现了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被检出病毒分离株的9.1%。结果揭示了宁夏地区PVY的进化与变异类型，有助于针对性地防控PVY。

关键词：马铃薯（Solanumtuberosum）；马铃薯Y病毒；分子变异

：S532：A：0439-8114（2014）22-5558-04

马铃薯（Solanumtuberosum）Y病毒（PotatovirusY，PVY）在世界各地均有报道，其能侵染34个属170余种植物，但主要以茄科作物为主[1]。PVY是危害我国马铃薯的主要病毒之一[2]。PVY包括3个株系组：马铃薯Y病毒普通株系组（PVYO）、马铃薯点条斑株系（PVYc）、马铃薯Y病毒褐脉株系（PVYN）[3]。PVY染病植株25℃时其体内病毒浓度最高，有利于该病的发生；30℃时染病植株体内病毒浓度最低，表现为隐症。PVYO和PVYC初期感染症状主要是叶片坏死和斑驳；PVYN则导致不同程度的花叶。PVYO和PVYC继发侵染的植株表现出矮化、皱缩、斑驳和卷曲等症状；而PVYN感染植株通常为花叶和斑驳，当温度低于10℃和高于25℃时，不表现花叶症状。PVY通常不引发块茎病症，但近年来在欧洲出现PVYN中的一个株系PVYNTN，PVYNTN株系具有PVYN株系的血清型，在烟草和马铃薯地上部分引起的症状与PVYN株系相似。同时PVYNTN株系还可引起马铃薯块茎坏死、环斑病，在块茎的内部或外部引起环状、弧状坏死斑，严重影响马铃薯的品质和经济价值[1]。

血清学方法最常用于PVY株系的鉴定，但单纯的血清学关系已被证明不完全可靠，因为许多病毒编码的蛋白质都有高度保守的区域，即使亲缘关系很远的病毒在这些保守区域序列也可能相近，导致血清学反应难以区分。近年来，随着基因测序技术的成熟，大量病毒衣壳蛋白（CoatingProtein，CP）基因的序列被测定，而且测定了不少病毒的全序列。CP基因序列分析在一定程度上对阐明PVY分类具有一定的参考作用[4，5]。

RNA植物病毒的遗传多样性主要由突变、重组、重排等因素造成[6-8]，以快速适应多变的生存环境。PVY突变频率较高、重组频繁，造成遗传多样性变化很大，因此能在不同寄主和不同环境中生存与传播。研究病毒变异和进化有助于了解病毒的起源、进化机制、分类关系和种群遗传结构的形成。本研究对宁夏地区流行的马铃薯Y病毒CP基因进行测序，研究其分子变异，有助于掌握该病毒的变异类型与流行区域，从而更为有效地防控该病毒的大面积流行。

1材料与方法

1.1材料

2011年，在宁夏固原农业推广总站马铃薯种质资源圃中，收集195份疑似携带马铃薯Y病毒样本。该资源圃中种植了目前全区大多数主栽马铃薯品种，选择有病理症状明显，从植株的顶部、中部和底部各取一片叶子合在一起，带回实验室-70℃低温保存。

1.2试剂

马铃薯Y病毒通用ELISA试剂盒购于安德珍生物公司；SVTotalRNAIsolationSystemRNA提取试盒、mProm-IIReverseTranscriptaseRNA反转录试剂盒、WizardSVGelandPCRClean-upSystem离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于Promega公司；TaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000plus购于天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；其他化学试剂均为分析纯。

1.3方法

1.3.1马铃薯Y的鉴定称取0.10～0.15g马铃薯病叶样品放置于样品袋中，并标记；然后向样品袋中加入1.0～1.5mL试剂盒提取缓冲液，将样品充分研磨；将样品袋中的溶液转移到1.5mL的离心管中，4000r/min离心3min，取上清液备用。按试剂盒说明进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）鉴定马铃薯病叶样品，在典型阳性植株中根据显色吸光度由高到低选取11株备用。

1.3.2马铃薯总RNA的提取采用SVTotalRNAIsolationSystem试剂盒提取样品总RNA，然后保存于-7