猪生长抑素SSRNAi效应的假型慢病毒制备.doc

猪生长抑素（SS）RNAi效应的假型慢病毒制备

摘要：动物的生产性能是畜牧业发展过程中的重要经济性状，生长抑素(SSI)是抑制动物生长的主要因素。SST主动免疫和添加SST抑制剂虽然取得了一定的效果但是仍不理想，而传统的育种方法在改善动物的生长性能方面进程非常缓慢，因而探索探索新的方法和技术十分必要。RNAi是下调靶基因的有效方法，慢病毒载体也是目前应用前景最广泛的基因转移载体，本试验根据靶基因SST设计和筛选出了最优RNAi效应的靶基因-shRNA序列，并已成功构建到慢病毒载体上，通过慢病毒载体和精原干细胞介导联合制备出稳定表达靶基因-shRNA的可遗传的转基因动物，利用RNAi效应在动物整体水平上下调SST的表达，从而到达提高动物生产性能的目的。

关键词：生长抑素RNAi效应假型慢病毒

正文：

1引言

1.1生长抑素对动物生长的抑制作用：

动物生长的过程受很多激素调节，其中生长激素（GH，GrowthHormone）是调节动物生长的核心之一。而GH的释放又主要受正负两种因子调控，其中正性调控因子生长激素释放因子(GRF，GrowthHormoneReleasingFactor；SRF，SomatotrophinReleasingFactor)又称生长激素释放激素(GHRH，GrowthHormoneReleasingHormone)是存在于人和动物体内的一种生物活性物质，主要由下丘脑合成并分泌，能特异的诱导生长激素的合成与分泌；负调控因子生长激素释放抑制因子(SS，SomatostatinorGHRIH，GrowthHormoneRelease-inhibitingHormone)又称生长抑素，与GRF一起，调节人和动物体内生长激素的浓度。

SS于1972年首次发现能抑制GH的分泌，目前在生产上采取降低SS水平，解除SS对GH、IGF－I等的抑制，达到促进动物生长的目的。通过人工调控GRF、SS浓度的方法来促进动物的生长，提高生产性能是目前研究的热点。随着胚胎技术和转基因技术的发展，在动物整体水平上敲除或沉默目的基因或导入外源基因改良动物的生产性能已得到了广泛的研究与应用。一种比较好的研究思路和策略就是在整体水平上敲除或沉默SS基因或降低表达水平可长久性、可遗传性获得低SS水平的转基因动物。

1.2RNA干涉技术

近年来的研究表明，一些短片断的双链RNA（dsRNA）可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi，RNAinterference）。因此，RNAi是dsRNA介导的序列特异性转录后基因沉默效应（PTGS，post-transcriptionalgenesilencing）。小干扰RNA（siRNA，smallinterferingribonucleicacid）就是这种短片断dsRNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA。RNAi具有高度特异性、高沉默效率、广抑制范围、高度稳定性以及操作简单、重复性好等优点。siRNA作用与应用研究自2001年以来，连续被美国《Science》杂志评选为年度十大科技突破之一。RNAi技术被广泛应用到包括功能基因组学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等；RNAi技术也已经迅速而广泛地应用到基因功能研究、基因表达调控机制研究等热门领域。由于siRNA在哺乳动物细胞中可以诱导RNAi效应，现也被广泛用来抑制特定基因的表达。

选择在动物生长调控中起重要作用的负调节因子-生长抑素（SS）作为靶基因，制备最优RNAi效应的假型慢病毒，以便从遗传角度有效获得促生长的优良转基因动物，为畜牧业动物育种改良可提供良好的经济利益和社会效益，也为这项技术早日进入实际应用打下基础，并可为研究动物生长调控提供有益的动物模型。

本实验技术技术在方法上创新性为动物整体水平上缄默SS基因表达提供优良RNAi效应的shRNA序列；在思路上前沿性提出利用慢病毒载体与RNAi技术相结合廉价，为快速生产SS基因部分缄默的转基因动物模型奠定一定的实验基础。

生长抑素SS是动物生长激素GH释放的负性因子，其在血液中浓度下降（如免疫中和）能间接促进动物生长、提高动物的生产性能。下调SS基因的表达成了改良动物生长性能的方法。我们用基因转染技术在动物体内表达SS-HBsAg融合蛋白产生中和抗体得到促生长效果。RNAi缄默靶基因的表达在多种生物体内获得成功应用。shRNA是模仿体内miRNA的结构而构建的能在细胞内表达的短发夹RNA，引起特异的RNAi效应。慢病毒载体能感染分裂细胞也能感染静止细胞，有很强的感染和整