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制备单克隆抗体的技术要点

1．交瘤技术的技术流程

如图4-1所示。

图4杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程

2．技术要点

1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系

Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血

清的制备，也可采用脾内直接免疫法。

2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含

8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复

HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞

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用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一

次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。

3）细胞融合融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无

菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。瘤细胞与脾细胞之比为1：8～

10，在l～2min内滴加50%PEG1.0ml边加边摇，静置1-2min。然后

再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。1000rpm离心

10min。最后加含20%小牛血清的HAT培养液。将细胞混匀，接种于

96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬

液。

4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次

检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。

具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行

选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA

法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才

确定为阳性克隆进行扩增。

5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆

化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，

有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克

隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。

（1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。

这种方法操作复杂，效率低，故不常用。

（2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定

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的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆

细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生

长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经

2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意

义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。

（3）软琼脂法：将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混

悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞

培养的目的。但此法不如有限稀释法好。

（4）荧光激光细胞分类法：用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂

交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进

行单细胞培养。

6）细胞的冻存与复苏细胞冻存与复苏的总原则是缓慢冷冻和快

速复苏，反之则容易导致细胞内的冰晶形成。细胞株用5%～10%甘

油或二甲基亚砜(DMSO)为保护剂，并含有高浓度(40%～60%)的小

牛血清，在液氮中保存。细胞悬液以10C～30C/