酵母表达系统.ppt

甲醇酵母系统胞内表达载体表达载体类型需要带入ATG单位点第32页,共43页，星期六，2024年，5月甲醇酵母系统胞内表达载体表达载体类型需要带入ATG多位点第33页,共43页，星期六，2024年，5月甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：PHO1第34页,共43页，星期六，2024年，5月甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：MFα第35页,共43页，星期六，2024年，5月甲醇酵母系统分泌表达载体信号肽：MFα标记：Kan第36页,共43页，星期六，2024年，5月4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策载体稳定性基因剂量整合位点甲醇利用表型mRNA5’端AT含量分泌信号表达产物稳定性第37页,共43页，星期六，2024年，5月1）载体稳定性同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高YRp型载体的稳定化：选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时，整合位点不确定。采用YIp型载体:更易实现整合、整合位点清楚第38页,共43页，星期六，2024年，5月2）基因剂量外源基因表达存在基因剂量效应筛选多拷贝整合子载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子构建高拷贝整合型表达载体第39页,共43页，星期六，2024年，5月3）整合位点外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均可高效表达毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低4）甲醇利用表型在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达第40页,共43页，星期六，2024年，5月5）mRNA5’端mRNA5’端非翻译区（UTR）的组成与长度应尽量与AOX1/MOX的一致应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构6）基因序列的AT含量AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构第41页,共43页，星期六，2024年，5月7）分泌信号分泌表达效率与所用分泌信号高度相关可采用酿酒酵母来源的MFα、PHO或SUC等的信号肽，或野生型信号肽，但适用性要比较分析。第42页,共43页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第43页,共43页，星期六，2024年，5月关于酵母表达系统三酵母表达系统甲醇酵母表达系统酿酒酵母表达系统其它酵母表达系统第2页,共43页，星期六，2024年，5月（一）酿酒酵母表达系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母系统启动子酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母糖基化系统第3页,共43页，星期六，2024年，5月1、酿酒酵母启动子UASURSTATA起始位点编码序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、转录起始位点；4、URS：上游阻遏序列2、TATA盒：富含AT；5、DAS：下游激活序列3、UAS：上游激活序列;DAS第4页,共43页，星期六，2024年，5月1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH磷酸甘油激酶基因PKG乙醇脱氢酶基因ADH酿酒酵母表达系统常用启动子第5页,共43页，星期六，2024年，5月2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、GAL1、GAL7和GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差半乳糖诱导、葡萄糖抑制第6页,共43页，星期六，2024年，5月2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录半乳糖诱导、葡萄糖抑制PromoterGAL10第7页,共43页，星期六，2024年，5月3）pho4TS-PHO5启动子A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子C、pho4TS温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达低温诱导、磷酸盐抑制第8页,共4