糖尿病模型小鼠肝脏线粒体的蓝绿温和胶电泳分析.docxVIP

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糖尿病模型小鼠肝脏线粒体的蓝绿温和胶电泳分析

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摘要：线粒体膜复合体活性下降，会引发呼吸链缺陷，有可能导致糖尿病产生。可采用蓝绿温和胶电泳对线粒体膜上的复合体进行分离研究，从分子水平上探索糖尿病的发病机制。纯化完整的正常小鼠与糖尿病模型小鼠肝脏线粒体，采用非离子去垢剂增溶，非变性梯度凝胶电泳方法进行膜复合体分离，再辅以2D以分离这些复合体的亚基，找出二者的差异蛋白点，进行质谱检测分析，鉴定出四个差异蛋白，Cps1、Mdh2、Aldob、Otc，这些线粒体膜蛋白在糖尿病产生过程中发生下行性变化，提示这些线粒体蛋白可以为糖尿病发生机制提供一些参考。

关键词：呼吸链复合体；糖尿病；蓝绿温和胶电泳；肝脏线粒体；差异蛋白

Abstract：Decreasedactivityofthemitochondrialmembranecomplexmaycauserespiratorychaindefects,whichmayleadtodiabetes.Amingtoexplorethemolecularpathogenesisofdiabetes，Weusedblue-nativepolyacrylamidegelelectrophoresistofractionthemitochondrialmembranecomplexes.Inthestudy，wepurifiedthelivermitochondriaofnormalanddiabeticmodelmicebynon-ionicdetergent,fractionedthemembranecomplexesbynon-denaturinggradientgelelectrophoresis，using2Dtoseparatethesubunitsofthesecomplexes.Weusedthedifferentialproteinspotstoperformmassspectrometryanalysis,finally，weidentifiedfourdifferentialproteins,Cps1、Mdh2、Aldob、Otc，thesemitochondrialmembraneproteinsintheprocessofdiabetesproduction,suggestingthatthesemitochondrialproteinscanprovideamechanismfordiabetesSomereferences.

Keywords：respiratorychaincomplex；diabetes；BN；mitochondrialdifferentialprotein

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前言

糖尿病已逐步成为威胁人类健康的一种重大的疾病，目前在我国人口患病率已达3%。根据发病机制不同可以将糖尿病分为Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。Ⅰ型糖尿病是由于胰岛素分泌不足或者不分泌导致的葡萄糖代谢途径受阻；Ⅱ型糖尿病是由于胰岛素抵抗即对胰岛素不敏感造成，95%以上的糖尿病患者都属于此型。近年来有研究表明，糖尿病的产生可能与线粒体功能失调相关[1,2]。线粒体是一种几乎存在于所有真核细胞中的富含膜结构的细胞器，在胞内众多代谢途径都发挥着重要作用，例如调节钙离子平衡，释放凋亡信号促进细胞凋亡等等，但其最主要功能还是为细胞生命活动提供能量[3]。葡萄糖代谢时，电子经由线粒体呼吸链被传递至氧分子，产生一些氧自由基，成为活性氧簇ROS（reactiveoxygenspecies）。正常生理状态下，ROS会被胞内或胞外的抗氧化系统清除，但在高血糖环境下（糖尿病患者），线粒体中过多生成的氧自由基可激活多元醇途径，又能够促进ROS的生成，形成恶性循环[4]。由于线粒体的代谢紊乱导致ROS过量，ROS能与脂质，蛋白或DNA分子结合，引起细胞毒性。除此之外，ROS还能激活体内的一系列应激信号通路，发生氧化应激的组织损伤[5]，其中就包括胰岛细胞的损伤，引发胰岛素抵抗，导致糖尿病产生。许多线粒体病例如糖尿病、衰老、神经退行性疾病等，它们的共同特征都表现为线粒体膜复合体活性下降，从而引发呼吸链缺陷。基于此，可对线粒体膜复合体进行分离研究，从分子水平上探索线粒体病的发病机制。膜蛋白疏水性强，且多以复合体形式存在，分子量较大，对它的分离不能采用传统的SDS或2D技术，基于此，1991年Schagger等