水产动物疾病学 水产动物病理学《病理学》实验方案.pdfVIP

罗非鱼链球菌病研究的实验方案

一、实验流程

采集病鱼→观察记录临床症状→分离纯化病原体→病原体的扩大培养→病原体的药敏试验

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动物回归实验

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观察记录临床症状

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病理组织分析

二、具体操作步骤

1.病鱼录临床症状的观察和记录

记录病鱼的活动特征、外观临床症状，解剖后观察内部器官病变特征，拍照。

2.病原体的分离纯化

对具典型细菌性症状的病鱼进行现场分离，取其脑（B）、肝（L）、脾（S）、

肾（K），采用平板划线法接种于BHI固体培养基中，于27-28℃培养箱中培养

24-72h，拍照。将首次分离培养基上数量呈优势的疑似病原菌落进行进一步的分

离纯化培养，对其进行革兰氏染色和镜检初步确定其是否为病原菌，拍照。

3.病原体的扩大培养

取上述纯化的菌株单菌落接种于BHI液体培养基中，进行扩大纯培养。

4.病原体的药敏试验

配置固体培养基→取0.2ml菌液均匀涂布于表面→干燥5mins后每板贴5片

药敏试纸，试纸之间距离不小于24mm→反转平板，4℃放30min→37℃中反转

培养24h→观察抑菌圈→拍照

5.动物回归实验

将扩大培养病原体的病原体经腹腔注射入罗非鱼，6天后开始每天观察发病

情况，记录病鱼的活动特征、外观临床症状，解剖后观察内部器官病变特征，拍

照。跟最初的病鱼进行比较，看是否症状一致，如果一致，说明分离到的菌株是

致病的病原体，如症状不一致，则病原体分离错误。

6.病鱼病理组织分析（可选做）

取病鱼的病变组织（如皮肤、脑、肝、肾脏、脾脏等）进行病理切片分析，

与正常组织对比，拍照，分析病变原因。

三、作业

将上述实验流程和实验结果整理，写成一篇课程作业，图文并茂。

附件：石蜡切片的制作方法

一、取材

用丁香粉麻醉鱼，取病变组织（如皮肤、脑、肝、肾脏、脾脏等），在Bouin

氏液固定8-24小时。取材时应注意以下事项：

1.所取材料不宜太大以0.5×0.5×0.2厘米或1.0×1.0×0.2厘米较合适。

2.切取的组织应能代表整个器官的结构，即器官的各部分结构都能看到。

3.取材时刀要锋利，要注意不要挤压器官以免损伤内部组织。宜轻轻用镊子夹

住，再用剪刀或刀片切下，被镊过的部分不要，切取的材料可稍大些，尤其

是柔软的组织经固定数小时后，待其稍为硬化再修切成小薄片，继续固定。

4.修正组织块时要注意切面平整，作横切面或纵切面要先考虑好，各种组织多

取数块，留有余地，以备必要时应用。

5.固定剂的用量一般为材料体积的10-15倍或稍多，含水分多的材料，固定液

即使增至材料的50倍，也不算多，因其含水分多可冲淡固定液的浓度致影

响固定效果。同一标本管内，材料不能放得太多以免与容器粘贴造成固定不

良。

6.如固定超过12小时，或固定液混浊不清就须更换新液继续固定。

7.不同的纽织应分别装入小瓶，其中事先装好固定液，用墨汁或铅笔写好标签

放入固定液内。

8.固定时间：一般12-24小时，须视组织块的大小性质及固定液的性质而定。

二、洗涤

1.Bouin氏液固定的组织：倒去固定液入70%酒精更换数次即可脱水。如欲除

去苦味酸的黄色可在70%酒精中加入少量氨水（数滴），且能中和苦味酸，

更换数次新液，或滴入碳酸锂饱和水溶液至黄色除去为止。

2.Helly或Zenker氏液固定的组织：倒去固定液组织块用纱布包扎，用流水冲

洗12-24小时左右，至组织发白，即可投入50%或70历酒精中开始脱水。

3.福尔马林固定的组织：可直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。

三、脱水与透明