基因工程原理与技术-5.ppt

第五章聚合酶链式反响

(polymerasechainreaction，PCR)

PCR是体外快速扩增目标DNA序列的技术

1971年Khorana等提出“在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA”的设想。

1983年Mullis创造了PCR技术。

1988年Saiki等将耐热TaqDNA聚合酶引入了PCR技术。

1989年PCR被美国《Science》杂志列为十余项重大科学创造之首。

1993年Mullis荣获诺贝尔化学奖。

应用领域：生命科学、医学、法医学及考古学。;第一节PCR原理

①遵循DNA体内复制原理，半保存式扩增；

②扩增序列取决于设计一对引物(正向引物、反向引物)，有效扩增长度为2kb左右；

③扩增循环包含变性、退火、延伸3个阶段；

④30~35个循环后，目标序列呈指数级扩增(2n-2);第二节PCR反响体系

一、反响体系;二、反响参数;三、影响PCR的因素

1、反响成分

①引物；浓度、长度

②DNA聚合酶；种类(Klenow酶、Taq酶、Pfu酶)、用量

③dNTP；浓度、比例

④Mg2+；影响TaqDNA聚合酶的活性和真实性、引物退火、模板解链温度、产物的特异性、引物二聚体生成等。

⑤反响缓冲液；pH8.3，KCl能促使引物退火、但浓度大于50mmol/L抑制酶活性。

⑥模板DNA。用量，线性DNA扩增效果大于环状DNA。;2、反响条件

①变性的温度和时间；热启动降低非特异性扩增

②退火的温度和时间；取决于引物的长度、浓度和碱基组成，退火温度为Tm-5℃。退火温度越高，扩增特异性越高。

③延伸温度和时间。延伸时间长短取决于目标序列的长度、及延伸温度的上下。对2kb长目标序列扩增时间多采用1min(72℃时)。;四、平台效应

平台效应是指PCR反响后期扩增产物不再随循环次数而明显上升、反响曲线变得平坦的现象。;引起平台效应的因素：

①dNTP或引物等消耗殆尽；

②酶活性逐渐降低；

③最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链DNA)；

④非特异性产物与模板的竞争作用；

⑤在高产物浓度下产物变性不完全；

⑥低浓度的非特异产物开始大量扩增。

PCR的特点：

①灵敏度高

②简便、快速

③对样品纯度要求低;第三节聚合酶链式反响引物设计原那么

一、引物设计的总原那么

提高特异性扩增，降低非特异性扩增。

二、引物设计的一般原那么

①引物长度应为15~30个核苷酸，Tm接近72℃较佳；

Tm＝(G＋C)×4＋(A＋T)×2

②引物中碱基分布应是随机的，防止出现一连串单一碱基以致产生二级结构；

③G＋C碱基的含量在45％~55％左右；

④引物3’端必须与模板互补，5’端可以不互补

⑤引物中连续互补碱基应小于4个；

⑥引物间连续互补碱基应小于4个。;三、引物3’端的末位碱基

引物3’端的未位碱基：优选A，其次是G、C，不要选T。因为当未位碱基为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成；而未位碱基为A时，错配时的引发效率大大降低；假设为G或C，那么引发率居于其间。当然，设计简并引物时，3’端末位碱基选T会得到较好的效果。

四、引物设计软件

Oligo6.57

Primer5.0;第四节PCR的类型

一、DNA序列的PCR扩增

1、巢式PCR

不受平台效应限制，扩增灵敏度增加1000倍，;2、热巢式PCR

第二对引物之一标记放射性物质，电泳检测时灵敏度增高，可测出106个细胞中的一个DNA分子。

3、半巢式PCR(见以下图);4、不对称PCR

采用两种不同浓度的引物(50:1)。

主要用于制备DNA测序的单链模板以及制备杂交探针。;5、等位特异性PCR

用于检测点突变。在引物的3’端设计了突变碱基，突变引物与正常模板间扩增受阻，电泳分析时，不出现谱带，反之那么会出现特定谱带。但有些错配碱基不能完全阻止引物延伸。

6、竞争引物PCR

用于检测特定位点的点突变。设计两个等位特异性引物，一个是正常的，另一个