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酶联免疫法

酶联免疫吸附实验ELISA

一．实验目的

酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay简称

ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatictechniques）的基础上

发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）

吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）,再加相应酶标记

抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记

抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计

的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产

生成正比。

二．实验原理

用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ

－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸

葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷

酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原

反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无

法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血

红素（protonhemin）区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表

示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸

收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm

403nm1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，

即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml计算是HRP的A（1cm403nm

mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit

Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0

左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0

以上。

ELISA的基本原理有三条：

（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和

聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；

（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结

合物仍能保持其免疫学和酶学活性；

（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反

应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相

应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试

验结果。

ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原

微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也

已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结

果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动

化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以

检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法

不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以

也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的

应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成

份的定位。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。

4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

基本方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋

白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，

4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

（简称洗涤，下同）。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔

中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及

阳性对照孔）。