浅谈蛋白质的亚细胞定位的研究方法.pdf

浅谈蛋白质的亚细胞定位的研究方法--第1页

关于研究蛋白质细胞定位的几种方法

姓名：甄萍萍导师：梁建生

真核细胞具有复杂的亚细胞结构，已发现数十种细胞器，每种细胞器都有一组特定的蛋

白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合

成，最终运送到不同地点，形成成熟蛋白并行使功能。译产物中很大一部分是以前体蛋白形

式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白在胞内定位。蛋白质在细胞内的定位问题，

是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。了解某些蛋白质的定位从

而分析探索其生物学功能，意义重大。目前，这方面的工作己取得很大进展。细胞器不同，

相应的靶向蛋白的定位过程也不同。

研究蛋白的亚细胞定位可采取多种方法：免疫胶体金标记；免疫荧光；与gfp构建融合

基因，用荧光显微镜观察;蔗糖密度梯度离心;多糖序列分析等。以下介绍免疫胶体金标记、

免疫荧光、与gfp构建融合基因等常用方法。

1免疫胶体金标记

金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。当用金标记的抗体

与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金

颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于

生物学的各个方面，并取得了可喜的进展。胶体金是由氯金酸（HAuCL）在还原剂如白磷、

4

抗坏血酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，

称为胶体金。

免疫胶体金标记电镜技术广泛应用于细胞及组织内蛋白的定位研究，是利用胶体金在

碱性环境中带负电的性质，使其与抗体相吸引，从而将抗体标记。电镜水平的免疫金染色是

目前较理想的免疫定位方法，具有特异性强、灵敏度高、定位准确和具有双重标记功能等优

点。例如用连有15nm金颗粒的GFP单克隆抗体以及连有lOnm金颗粒的过氧物酶体的标志酶

抗体作为一抗进行免役金标，证明CAT1-GFP定位在过氧物酶体(AkaneKamigaki

eta1.,2003)。

2免疫荧光

根据抗原与抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物荧光

标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

在细胞或组织中形成的抗原或抗体复合物上含有各种颜色的荧光素，利用荧光显微镜观察标

本，荧光素受激光的照射而发出各种颜色的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确

定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。用荧光抗体示踪或检查相应抗原

的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。

这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或

组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。

S.pagny等(2003)将XYIT36:GFP转入拟南芥，检测发现荧光出现在高尔基体。使用

植物Lewis(高尔基体标志分子)抗体以及BIP(内质网标志分子)抗体进行免疫荧光标记，发

现GFP的绿色荧光与使用Lewis抗体所做的免疫荧光存在共定位，而与BIP分布在不同部位。

说明XYIT36:GFP定位在高尔基体。

1

浅谈蛋白质的亚细胞定位的研究方法--第1页

浅谈蛋白质的亚细胞定位的研究方法--第2页

3GFP及其在生命科学研