TGXAS 685-2024 污水中猪蓝耳病病毒的检测 实时荧光RT-qPCR法.docxVIP

ICS

07.080

CCS

B40

GXAS

团 体 标 准

T/GXAS685—2024

污水中猪蓝耳病病毒的检测 实时荧光

RT-qPCR法

Real-timeRT-qPCRfordetectionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinwastewater

2024-03-05发布 2024-03-11实施

广西标准化协会 发布

T/GXAS685—2024

前 言

本文件参照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西农业职业技术大学提出并宣贯。

本文件由广西标准化协会归口。

本文件起草单位：南宁壮博生物科技有限公司、广西扬翔股份有限公司、金陵农牧集团有限公司、巨星农牧有限公司、深圳市京基智农时代股份有限公司、济凡生物科技（常州）有限公司、广西农业职业技术大学。

本文件主要起草人：林晓、余腾、陈俭、曾南方、伍少钦、张瑞竹、林鑫、覃军、王丽、钱平、李健、郭增良、黄震、杨亮、邝贞结、张伟超、殷玉鹏、罗莹盈、凌伟航、冯文春、侯宏波、龚小鹏、陈品、黄越、蒙兰飞、陈来运、韩典霖、陆金、高福明、陈斌、俸祥仁、王树艳、李凤梅、谢江、陈海云、郑凤鸣。

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T/GXAS685—2024

污水中猪蓝耳病病毒的检测 实时荧光RT-qPCR法

范围

本文件界定了污水中猪蓝耳病病毒的检测实时荧光RT-qPCR法涉及的术语和定义，描述了污水中猪蓝耳病病毒实时荧光RT-qPCR的检测方法。

本文件适用于污水中猪蓝耳病病毒的检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB19489 实验室 生物安全通用要求

DB45/T921 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测 多重反转录聚合酶链反应法

术语和定义

DB45/T921界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

3.1

富集浓缩试剂 enrichmentandconcentrationreagent

富含聚乙二醇（PEG）的试剂，用于对大体积生活污水或其他水体样品中病原体的核酸片段进行浓

缩富集。

原理

向污水中加入富集浓缩试剂，富集浓缩试剂可使病毒颗粒快速形成多聚体，通过离心作用将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀。采用柱提法或磁珠法提取核酸和实时荧光RT-qPCR法来检测猪蓝耳病病毒。

试剂和材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中三级水的要求。

5.1 乙醇：75％。

磷酸盐缓冲液：1mol/L，pH值7.2。

富集浓缩试剂盒。

病毒核酸提取试剂盒。

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测试剂盒。

离心管：1.5mL、50mL。

移液器：10μL、200μL、1mL，带滤芯。

无菌聚乙烯瓶。

注：可使用商品化试剂盒。

仪器设备

低温冰箱：-20℃。

高速冷冻离心机：可控温至-4℃，离心速度为13000r/min。

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振荡混匀器。

实时荧光PCR扩增仪。

二级生物安全柜。

试验步骤

样品采集与处理

样品采集

根据采样场所排水系统分布情况，选取污水排水口、内部污水管网汇集处等关键位置，对未经消杀处理的污水进行采样。

用无菌聚乙烯瓶采集样品，体积为200mL～300mL。

样品贮运

样品采集后并标记标签，应在现场使用75％乙醇对采样瓶外表面喷洒或擦拭进行消毒，并及时将样品送至实验室，运输过程中样品温度保持在0℃～4℃。

实验室接到样品后宜在48h内进行检测。如未及时检测，应将样品置于-4℃条件下保存。

样品处理

将样品混合均匀，取同一场各3管40mL的样品分别置于3个50mL离心管中，在-4℃、2500r/min的条件下离心30min。剩余样品作为备份。

将7.1.3.1中所得上清液分别转移至富集浓缩试剂盒提供的预混试剂离心管中，使用振荡混匀器震荡30min，充分混合均匀。

在-4℃、12000r/min的条件下离心120min，离心机降速时不应使用制动力。将离心管从离心机上取出，完全倾倒离心管中的上清液并弃除。在相同条件下再次离心5min，将离心管从离心机上取出，用移液器从每个离心管中吸出上清液，移液器吸头不应接触沉淀