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微生食物中维生素B12的测定方法

微生物测定法

1.原理

维生素B12对于Lactobacillusleichmannii（ATCC7830）的正常生长是必需的，在一定生长

条件下，Lactobacillusleichmannii的生长与繁殖速度和溶液中维生素B12的含量成一定的线

性关系，利用浊度法或光密度法测定细菌生长和繁殖的强度可间接地测定食物样品中维生素

B12的含量。本方法最低检出限0.001ng。

2.适用范围

本方法参考、

以及

。本方法适用于测定食物及饲料

中的维生素B12含量。

3.试剂

本试验所用水均为蒸馏水，所用试剂均需分析纯试剂。

3.1甲苯

3.2柠檬酸（C6H8O7·3H2O）

3.3磷酸氢二钠（Na2HPO4）

3.4焦亚硫酸钠（Na2S2O5）

3.5抗坏血酸（生化试剂）

3.6无水葡萄糖

3.7无水乙酸钠

3.8L-胱氨酸（生化试剂）

3.9D,L-色氨酸（生化试剂）

3.1010mol/L氢氧化钠溶液：称取200g氢氧化钠溶于适量水中，定容至500ml。

3.11（1+4）乙醇溶液：200ml无水乙醇与800ml水充分混匀。

3.12酸解酪蛋白：称取50g不含维生素的酪蛋白于500ml烧杯中，加200ml3mol/L盐酸，

121℃高压水解6小时。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200ml水使

之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以去除盐酸。以溴酚蓝作外指示剂，用10mol/L氢

氧化钠调节pH至3.5。加20g活性炭，振摇，过滤，如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活

性炭重复处理。滤液加水稀释至500ml，加少许甲苯于冰箱中保存。（该试剂也可从Difco

公司购得，产品号为No.0288-15-6。）

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?酸解的目的是为了消除酪蛋白中的维生素，确保基本培养基中不含待测定的维生素B12，

但有时酸水解不一定彻底，所以一定要选用不含维生素的酪蛋白粉（Sigma公司），这样可

较好地确保酸解酪蛋白中不含维生素B12。

3.13腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤（纯度为98%）、盐酸鸟嘌呤（生化

试剂）以及尿嘧啶各0.1g于250ml烧杯中，加75ml水和2ml浓盐酸，然后加热使其完全溶

解，冷却，若有沉淀产生，加盐酸数滴，再加热，如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止，

以水稀释至100ml。加少许甲苯于冰箱中保存。

3.14维生素溶液Ⅰ：称取25mg核黄素，25mg盐酸硫胺素，0.25mg生物素，50mg尼克酸，

用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至1000ml。

3.15维生素溶液Ⅱ：将50mg对氨基苯甲酸，25mg泛酸钙，100mg盐酸吡哆醇，100mg盐

酸吡哆醛，20mg盐酸吡哆胺，5mg叶酸溶于（1+4）乙醇溶液，并定容至1000ml。

3.16甲盐溶液：称取25gKH2PO4、25gK2HPO4溶于500ml水中，加5滴浓盐酸。

3.17乙盐溶液：称取10gMgSO47H2O、0.5gNaCl、0.5gMnSO44H2O，0.5gFeSO47H2O