国家自然基金标书写作指导 实验方法总结 分子机制-蛋白检测篇.pdfVIP

编号：１－１

主题：WesternBlot（蛋白质印迹法）

概述：

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即WesternBlot，它是分子生物学、生物化学

和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳

处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特

定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

目的：

获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

原理：

与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺

凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过

PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体

以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同

位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异

性目的基因表达的蛋白成分。

步骤：

1.提取组织或细胞蛋白；

2.测定蛋白质浓度；

3.电泳：

电泳条件为：恒压100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止

（约120min）；

4.电转膜仪转膜：

转膜条件为：恒流250mA，2h（时间可根据目的蛋白分子量适当调整）；

5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭1h；

6.加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜；

7.收一抗，PBST洗膜3次，10min/次；

8.二抗孵育：

室温孵育1h，所用二抗的比例和种属见步骤9）表格。

9.洗膜：PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，10min/次。

10.显色

流程图：

编号：１－２

主题：免疫组化技术

概述：

免疫组织化学（Immunohistochemistry）是组织化学的分支，它是用标记的特

异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的

技术。凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、

受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中

被广泛应用。

免疫组织化学染色方法分类：

1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物

酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标

法和免疫金银法等。

2、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；

与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。

3、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法

和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素

蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等。

目的：

对所研究的大分子如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等进行

定位，进而深入研究其功能。

原理：

1、免疫荧光方法

免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原

理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在

荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一

定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由

于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中

应用比较广。

2、免疫酶标方法

免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶

标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具

有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分

进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。

3、免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金

的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。

因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄

球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定

量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体

金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金