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玉米单倍体与双单倍体的分子标记研究张益刘小烛

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论文导读：而在6种玉米单倍体样品种子的胚部，有着能与加倍单倍体区分开来的可染色的紫胚标记。在本研究中，值得关注的是与6种单倍体的紫胚标记相关联的分子标记的探寻。

关键词：玉米，单倍体育种，分子标记

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玉米的单倍体育种是一种利用孤雌或孤雄生殖的方式制造单倍体，然后通过自然或人工加倍的方式获得新品种的技术。如果把单倍体育种体系运用在转基因方面的研究中，则外源基因将在子代中得以稳定地遗传，并且不会发生性状分离。因此，单倍体育种能大大缩短育种周期[1]。

玉米单倍体技术主要有自然发生的单倍体、孤雌生殖、花粉、花药培养、传粉玉米子房诱导单倍体、远缘杂交单亲染色体消失、辐射诱导以及高频诱导单倍体材料等[2]。在获得玉米单倍体以后，需要进行单倍体鉴定确认，主要方法有：形态解剖学方法、细胞遗传学方法、生理生化法、射线照射法以及分子标记法等。论文格式。其中，以分子标记法最为准确可靠[3]。

在本研究中，在6种单倍体样品中存在紫胚标记。经过染色后，在其种子籽粒胚呈现深色的标记。而3种加倍单倍体经过染色却并未发生此种现象。紫胚性状是表现于籽粒胚部的当代性状,可不借任何仪器进行直观识别[4]。因此，这种胚标记成为了一种有效的鉴定单倍体的手段。

然而，如果能够从分子水平入手，寻找到与紫胚标记相关联的分子标记，则单倍体的鉴定确认将达到一个更为可靠、准确、快捷、简便的水平。汤飞宇等利用SSR标记并结合大田农业形状，对玉米178X黄C杂交种子房培养的再生植株后代进行遗传分析，结果证明两个株系在随机检测的20个位点上均表现纯合，为自发加倍的双单倍体[5]。

而RAPD（随机扩增多态性DNA）作为一种基于PCR技术的快捷而简便的分子标记手段，被广泛应用于各种单倍体育种研究中。朱旭芬等从酿酒酵母的耐热菌株HU2TY21中分离了单倍体HZ系列，并选取HZ221、HZ284菌株进行RAPD的分析,显示单倍体菌株与它们的二倍体亲株以及原始出发菌株LK的基因组之间确实存在着多态性DNA片段，其中有些可能与菌株的耐热性有关[6]。

分子标记技术已经应用到了玉米育种的许多环节,带来了前所未有的变革,真正实现了由表型选择向基因型选择的过渡。随着分子生物技术的飞速发展和不断完善,DNA分子标记技术必将为高精度种子纯度检测和品种鉴定展现出美好、广阔的前景[7]。

1材料和方法1.1材料从某农业种子公司取得的，包括3种玉米加倍单倍体样品：MWD31,MWF26,MWD40;和6种单倍体样品：SH17,SH19,SH20,SH21,SH27,SH30.

而在6种玉米单倍体样品种子的胚部，有着能与加倍单倍体区分开来的可染色的紫胚标记。

1.2方法（1）基因组DNA的提取。（试剂盒法提取，上海捷瑞生物工程有限公司）（许理文等采用试剂盒法提取玉米基因组DNA并取得了较好的结果[8]）

（2）RAPD与电泳处理。李尚禹等采用RAPD方法对6种玉米杂交种及其父母本的指纹图谱进行鉴别，得出了差异显著的图谱，说明RAPD可以用来进行玉米品种鉴定和纯度鉴定[9]

（3）电泳图谱的分析（琼脂糖凝胶电泳）

（4）根据筛选出的引物所扩增出的电泳条带构建出9种样品的亲缘关系树型图。（刘湘丹等采用RAPD技术对百合鳞叶基因组DNA的多态性进行分析，利用紫外凝胶成像系统通过对电泳图像分析建立了百合基因组DNA指纹图谱，并利用NTSYS软件进行品种品系间UPGMA聚类分析[10]）

2结果分析表1从100个随机引物中筛选出的较理想的22个引物

Table1The22satisfiedprimersselectedfrom100randomprimers

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OPA04

5’-AATCGGGCTG-3’

OPC10

5’-TGTCTGGGTG-3’

OPA07

5’-GAAACGGGTG-3’

OPC13

5’-AAGCCTCGTC-3’

OPA09

5’-GGGTAACGCC-3’

OPD07

5’-TTGGCACGGG-3’

OPA12

5’-TCGGCGATAG-3’

OPD13

5’-GGGGTGACGA-3’

OPA18

5’-AGGTGACCGT-3’

OPD16

5’-AGGGCGTAAG-3’

OPB01

5’-GTTTCGCTCC-3’

OPD19

5’-CTGGGGACTT-3’

OPB03

5’-CATCCCCCTG-3’

OPE01

5’-CCCAAGGTCC-3’

OPB17

5’-AGGGAACGAG-3’

OPE04

5’-GTGACATGCC-3’

OPB18

5’-CCACAGCAGT-3’

OPE07

5’-AG