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生物化学与分子生物学实验

1.分光光度计

（1）基本原理：溶液溶质在其一定波长的吸收光中，其吸光度值与液层厚

度和溶液浓度的乘积成正比，即遵循朗伯—比尔定律，通过也在一定

液体厚度时测定其吸光度来与标准曲线比较从而测得待测液溶质浓

度。

（2）吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯—比尔定律，

简称比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为：

A＝-lgT＝εbc

A：吸光度，又称光密度“”；

ε：吸光系数〔L·mol－1·cm－1〕；比例常数，称吸光系数

b：样品光程〔cm〕，通常使用1.0cm的吸收池，则b=1cm；

c：样品浓度〔mol/L〕。

吸光度“A”具有加和性,即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度

的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。

假设溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。

例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定260nm的吸光度为，用同一吸收池测定

3-1

纯溶剂的吸光度为，已知其摩尔吸光系数×10Mcm，计算其摩尔浓度.

∵A＝εbC

∵A＝〔溶剂加样品的吸光度〕－〔溶剂的吸光度〕

∴A＝－＝

∵b＝1cm

-5

∴×10mol/L

〔2〕等电点的计算方法；

标准曲线的制作

〔1〕配置一系列浓度不同的标准溶液。

〔2〕在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。

〔3〕以标准溶液浓度为横坐标〔不必考虑显色剂等引起的浓度变化〕，以相应的吸光度为纵

坐标，绘制A-C关系图。

〔4〕在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。

2、酪蛋白的提取过程：

(1).原理；牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，它是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为。

利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质，将牛乳的PH调至时，酪蛋白就沉淀出来。用乙

醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯化的酪蛋白。

(2).主要试剂：牛乳醋酸钠缓冲液0.2M,PH４.6，乙醇，乙醚，氢氧化钠

PPT后面问题：

〔1〕醋酸缓冲液、蒸馏水、乙醇、丙酮洗涤沉淀的目的分别是什么？

醋酸缓冲液：调节PH到等电点。

蒸馏水：出去沉淀中的可溶物。

乙醇：除去沉淀中的脂类物质。

丙酮洗涤：脱水。

〔2〕最后所得的沉淀中加入NaOH的作用是什么？

酪蛋白是酸性蛋白质，溶解于碱性溶液中，方便下次双缩脲法测定。

〔3〕制备高产率酪蛋白的关键是什么？

刚开始时对牛奶的ph的调节,最好是调节到4.7,越接近越好,这是最主要的。

〔4〕请设计另一种提取酪蛋白的方法。

1、向酪蛋白溶液中加入高浓度(NH4)2SO4溶液

2、10000转/分,5分钟，去上清液

3、95%乙醇4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液

4、丙酮4ml洗涤离心，10000转/分，5分钟，去上清液

5、加水至10ml

3、双缩脲法测蛋白质含量

(1).蛋白质测定的5种方法:凯式定氮法〔Kjedahl法〕紫外吸收法双缩脲法〔Biuret法〕

Folin-酚试剂法〔Lorry法〕考马斯亮蓝法〔Bradford法〕

TCA：三氯乙酸

4.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量

原理：考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，染料主要是与蛋白质中碱性氨

基酸和芳香氨基酸残基结合，使染料最大吸收峰位置,由465nm变为595nm，溶液的颜色也

由棕黑色变为蓝色。在595nm下测定的吸光度A595，与蛋白质浓度成正比。

(1).干扰物质有哪些？TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等

(2).G250与R250的区别：比考马斯亮蓝R250多二个甲基，染色灵敏度不如R250,但比氨基

黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所

以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。

(3).PPT后的4个思考