分子生物学-许晓东-6.pptVIP

6.3.5RNA干涉技术及其应用RNAi（RNAinterference）技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于AndrewFire1998年在《自然》杂志上的论文。研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA,single-strandedRNA）的降解。经过Dicer（一种具有RNAaseIII活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，shortinterferingRNA），并有效定位目标mRNA。siRNA特征:5’磷酸、3’羟基，

两条链3’末端有两个碱基的突出。RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时,为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶,结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花,并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达。RNAi作用机制示意图（RISC:RNA诱导的沉默复合体）6.4基因芯片及数据分析基因芯片（DNAchip）,又称DNA微阵列（DNAmicroarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段,从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。Targetingstrategyandgenerationof?BHD?conditionalknockoutmice.PLoSONE20083(10):e3581.doi:10.1371/journal.pone.00035816.2.2高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体,用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中,使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。显微注射命中率较高,技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低,操作使用方便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。基因捕获法原理示意图无启动子的报告基因筛选报告基因6.2.3植物基因敲除技术T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化,将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上,如果这段DNA插入到目的基因内部或附近,就会影响该基因的表达,从而使该基因“失活”植物基因敲除及突变体筛选a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物,LB是指载体上的一段引物,目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。b.PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。ZFN技术锌指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶,利用不同的锌指结构识别特异DNA序列,利用核酸酶切断靶DNA。锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基；人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列,通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基,TGEK是多个螺旋间的连接序列；构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。扩展:锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑,比如基因敲除。已建立有ZFN库,识别多种DNA序列,但还不能达到识别任意靶DNA的目的,其应用受到一定的限制。TALEN=TranscriptionActivator-LikeEffector+FokINucleasefusionproteinTALEN技术长度为34aa的重复肽段中的第12.13个氨基酸可以特异识别DNA单个碱基，形成2aa-1bp的特殊coden。利用这个特性可以人工设计识别任意碱基序列的TALE蛋白。TALE:transcriptionactivator-likeeffectorfromXanthomonas,TALEcanspecificallybindandregulateplantgenesduringpathogenesis.codon扩展: