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夏橙类胡萝卜素合成关键酶基因的克隆及表达分析-论文网
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论文摘要：根据类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶八氢番茄红素合成酶（PSY）、八氢番茄红素脱氢酶（PDS）和ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）PSY、PDS和ZDS基因的氨基酸保守序列设计简并引物，利用RT-PCR技术分别从夏橙果皮中分离得到相应的三个cDNA片段，长度分别为：504bp、545bp和612bp；再根据得到的cDNA片段分别设计引物，利用3’RACE-PCR技术扩增得到各基因的3’端，并并与之相应的片段进行拼接后分别得到PSY、PDS和ZDS基因的3’末端全长。同源性分析表明，均与已报道的类胡萝卜素合成酶基因有不同程度的相似性。PSY、PDS和ZDS基因在夏橙后期发育和成熟过程中的表达分析证明PSY、PDS和ZDS基因是夏橙果皮类胡萝卜素合成中的关键酶基因，对夏橙果皮色泽形成及调控有重要作用。
论文关键词：夏橙,类胡萝卜素,克隆,基因表达
植物中，类胡萝卜素在光合作用过程中起着重要的作用，它担当叶绿体光合天线的辅助色素，帮助叶绿素接收光能，另外它还能保护叶绿素免受破坏(Niyogi，1999)；近年来，众多的医学研究表明，类胡萝卜素能有效清除人体中多余的自由基，防止自由基对细胞的氧化，延缓衰老(Miki，1991)，在预防人类心血管和防癌抗癌（BartleyandScolnik，1995；Giovannuccietal.,1995)等方面也起着重要作用。但人体不能自身从头合成类胡萝卜素，必须依靠食物中类胡萝卜素的供应，而水果及蔬菜是获得类胡萝卜素的重要来源。
夏橙（ValenciaOrange)，亦称伏令夏橙,在广东广泛栽培,是一种适应性强的重要柑橘品种。由
＊通讯作者：gerbera_mxc@126.com
于要越冬，到次年的2月份以后产生返青现象，即果皮颜色部分变青，因而在采收时单个果实往往呈黄绿相间的斑驳状，从而影响其商品价值。柑橘果皮中类胡萝卜素的含量与组成是决定柑橘果实外观色泽的重要色素。在以番茄为模式植物对类胡萝卜素的生物合成及其代谢和调控进行了大量的研究，并已取得了一定的进展；编码控制类胡萝卜素合成的关键酶八氢番茄红素合成酶（PSY）、八氢番茄红素脱氢酶（PDS）和ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）的基因
也相继研究，并已取得了一定的进展(Fraser,1994)；控制类胡萝卜素合成的关键酶基因PSY、PDS、ZDS也相继被分离。过去以甜橙和温州蜜柑为材在柑橘果实中类胡萝卜素的合成及调控的分子机理方面作了大量工作）。但对夏橙发育及成熟过程中类胡萝卜素积累及分子调控的相关研究至今未见报道，本文克隆了夏橙类胡萝卜素合成过程中三个关键酶基因的3’全长，为夏橙中进一步的类胡萝卜素合成调控及基因工程研究奠定基础。
1.材料与方法：
1.1材料
供试材料为四会市龙圃镇柑橘试验园栽培的5年龄夏橙（ValenciavalenciaLate)。取刚开始转黄的果实果皮用液氮速冻后于-80℃保存备提取总RNA。
1.2果皮总RNA的提取
提取及分离方法为热硼酸法，基本参照Wan和Wilkins（1994）的方法。主要分为三个步骤：RNA抽提；RNA沉淀；RNA的回收及纯化。采用分光光度计测定总RNA的含量。评价RNA的完整性，取10ug总RNA进行1.2%琼脂糖变性胶电泳。
1.3果皮总类胡萝卜素含量的测定
取样品5克于10ml80%丙酮中避光浸提24小时，在紫外分光光度计下分别测量浸提液在440nm、645nm和663nm三个波长的吸光值，根据文献的公式计算出夏橙果皮总类胡萝卜素含量。
1.43引物的设计及合成
为获得PSY、PDS、ZDS基因的cDNA片段，根据GenBank登录的水果等其它物种PSY、PDS、ZDS酶氨基酸保守序列设计合成三对简并引物，pPSY1-U：ATTCAGCCATTYMGAGAYATG，pPSY1-L：RAARTTGTTGTARTCATTSGC；pPDS1-U：CAAGRGATGTTCTWGGTGGA，pPDS1-L：RTTRCCATCYAARAAKGCCAT；pZDS1-U：RGGHCAYGAGGTGGATATA，pZDS1-L：ATDGGMCCACTCAARTAAAC采用RT-PCR技术扩增获得相应的cDNA片段。
为获得PSY、PDS、ZDS基因的3’全长，分别设计引物，PSY-3RACE：GTGTGACCGAGCTGAGTGAA；PDS-3RACE：AAGCAGGGTGTACCTGATCG；ZDS-3RACE：GCGGATGCTCAAGGGTTC；
为获得PSY、PDS、ZDS基因地高辛标记的探针。分别设计引物，PSY-DIG-U：GTGTGACCGAGCTGAGTGAA，PSY-DIG-L：CTGCTGATCAGAGCA
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