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（规范性）

产品微生物检测方法

B.1产品采集与样品处理

于同一批号的3个运输包装中至少抽取6件最小销售包装样品（若样品数量不能满足试验所需，则应相应增加采样数量），其中1/3样品用于检测，2/3样品用于留样。抽样的最小销售包装不应有破裂，检验前不得开启。

在空气洁净度5级净化条件下用无菌方法打开至少2个包装用于检测，从每个包装中取样，准确称取10.0g±1.0g样品。剪碎后加入到200mL灭菌生理盐水中，充分混匀，得到一个生理盐水样液（若产品太轻，可称取2.5g±0.2g样品，加入50mL灭菌生理盐水中）。液体产品吸取10.0mL原液直接作样液。

如被检样品具有抑菌或抗菌作用，应选择适宜的中和剂中和，稀释梯度最高不超过1∶100。无相应中和剂则选用薄膜过滤法去除样品中对微生物生长有影响的抑菌或抗菌成分，再按上述方法制备样液。

如被检样品含有大量吸水树脂材料而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按每次50mL递增，直至能吸出足够测试用样液。在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时相应调整稀释度。

B.2初始污染菌与细菌菌落总数检测方法

B.2.1操作步骤

按B.1得到的生理盐水或中和剂样液自然沉降后取上清液，如需要可进行10倍系列稀释。选择适宜的稀释度进行菌落计数。共接种2个平皿，每个平皿中加入2.0mL样液，然后用冷却至40℃~45℃左右熔化的营养琼脂培养基15mL～20mL倒入每个平皿内混合均匀。待琼脂凝固后翻转平皿置36℃±1℃培养48h，计算平皿上的菌落数。

B.2.2菌落计数

菌落呈片状生长的平皿不宜采用，确保2块平皿符合计数要求并进行菌落计数，按公式(B.1)计算

结果：

At=…………（B.1）

式中：

At─细菌菌落总数，单位为每克菌落形成单位（CFU/g）或每毫升菌落形成单位（CFU/mL）；

A0─2块营养琼脂培养基平皿上的细菌菌落总数；

K─稀释倍数；

2×2─2块平皿，每块平皿接种2.0mL样液。

首先选取平均菌落数在30CFU～300CFU之间的平皿。当菌落数小于或等于100CFU/g或CFU/mL，按实有数报告，大于100CFU/g或CFU/mL时采用二位有效数字；当2块营养琼脂培养基平皿上的细菌菌落总数为0CFU时，如为固体应当报告细菌菌落总数小于5CFU/g，如为液体按稀释倍数报告。

B.2.3结果报告

B.2.3.1如经首次检测，样品细菌菌落总数符合本文件的规定，直接按检测结果报告。

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B.2.3.2如经首次检测，样品细菌菌落总数超过本文件的规定，应用留存的样品依前法复测2次，然后才能报告结果。当2次复测结果都达到本文件的规定，则判定被检样品合格，以2次合格结果的均值报告；其中有任何1次复测结果超过本文件规定，则判定被检样品不合格，以所有不合格结果的均值报告。

B.3大肠菌群检测方法

B.3.1操作步骤

B.3.1.1增菌培养：取样液5.0mL接种至50mL乳糖胆盐发酵管内，置36℃±1℃培养18h～24h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌群阴性。

B.3.1.2分离培养：如产酸产气，则划线接种伊红美蓝琼脂平皿，置36℃±1℃培养18h～24h，观察平皿上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。

B.3.1.3染色镜检与鉴定：取疑似菌落1个～2个作革兰染色镜检，同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃培养18h～24h，观察产酸产气情况。

B.3.2结果报告

凡乳糖胆盐发酵管产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，在伊红美蓝平皿上有典型大肠菌群菌落，革兰染色为阴性无芽孢杆菌，可报告被检样品检出大肠菌群。

B.4铜绿假单胞菌检测方法

B.4.1操作步骤

B.4.1.1增菌培养：取样液5.0mL，加入到50mLSCDLP（SoyaCaseinDigestL