载体与宿主的选择.ppt

酵母人造染色体（YeastArtificialChromosomesYAC）酵母人造染色体的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI连接转化酵母菌重组酵母染色体第64页,共84页，星期六，2024年，5月第65页,共84页，星期六，2024年，5月插入大小质粒载体0-3kλ噬菌体载体0-10k或10-25kM13噬菌体载体1.5k粘粒载体20-45k人工染色体50-400k第66页,共84页，星期六，2024年，5月6真核细胞的克隆载体6.1酵母细胞中基因克隆常用载体共同特点（1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；（2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；（3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种类型的载体1.整合型载体（YIP）2.复制型载体（YRP）3.附加体型载体（YEP）第67页,共84页，星期六，2024年，5月YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。如Pyeleu10是由ColEI质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体（ShuttleVector）.穿梭载体在基因工程中广泛使用。YRP型载体转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2μm质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2μm质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2μm质粒，人们已经构建出许多YEP型载体。YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高（25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。第68页,共84页，星期六，2024年，5月6.2植物基因克隆的载体——Ti质粒Ti质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒（Tumorinducingplasmid），简称Ti质粒。第69页,共84页，星期六，2024年，5月T-DNA的染色体整合机制农杆菌介导法第70页,共84页，星期六，2024年，5月共整合转化程序第71页,共84页，星期六，2024年，5月二元整合转化程序第72页,共84页，星期六，2024年，5月6.3动物细胞基因克隆的载体:SV40病毒载体SV40病毒（猿猴空泡病毒40）呈小型20面体，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3构成。受纳细胞（permissivecell）：能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒，并使寄主细胞裂解，如猿猴细胞。非受纳细胞（nonpermissivecell）：不产生感染性病毒颗粒，但能整合到细胞染色体中产生癌变，如小鼠或仓鼠的细胞。SV40病毒载体1.取代型重组病毒载体2.重组的病毒-质粒载体第73页,共84页，星期六，2024年，5月取代型的重组病毒载体（recombinantVirusVector）,其特点是外源DNA直接插入在缺陷型的病毒基因组上。插入的外源DNA片段在大小同被取代的病毒基因组区段是等同的，这样形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充被取代的病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。①晚期区段取代载体②早期区段取代载体第74页,共84页，星期六，2024年，5月重组的病毒-质粒载体只取病毒基因组中维持在辅乳动物中进行复制的有关序列，使它与一个细菌质粒融合。含有完整早期区段的复制起点的病毒-质粒载体（如Pac10）：它是由病毒的早期区段和复制点同大肠杆菌的质粒分子重组而成。由于既能在大肠杆菌中复制，又能在哺乳动物细胞中复制，所以也称为穿梭载体。微型病毒复制子-质粒载体：只是把SV40复制起点片段插入到大肠杆菌质粒载体上，可用于特殊细胞系来克隆和表达比如前面讲的COS细胞。第75页,共84页