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实时荧光定量pcr实验报告--第1页
实时荧光定量pcr实验报告
篇一：实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介
一．实时荧光定量PCR的基本原理
理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）
指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，
随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合
酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线
性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光
信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法
（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起
始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也
完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始
拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的
根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性
反比关系。
Ct值是如何得到的
在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信
号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结
束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈
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值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义
Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测
threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强
度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值
线交点所对
应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系
Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关
系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。
与终点法相比利用Ct值的优势
由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指
数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此
利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台
期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接
的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。
下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、
相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct
值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300
个单位。
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此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防
止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的
扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统
方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造
成二次污染的可能性。
二．荧光定量PCR的2类方法（按荧光产生的原理分
类）染料法（SYBRGreen法）
染料法即利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行
样品定量。该方法与常规的PCR类
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