细胞及培养试剂中细菌、真菌快速检测通则TaqMan探针荧光定量PCR法.docxVIP

4原理

细胞及其培养试剂中细菌和真菌检测Taqman探针实时荧光定量PCR法

1范围

本文件定义了规定了细胞培养过程中细菌、真菌快速检测TaqMan荧光定量PCR方法的相关术语，检测环境，主要试剂和耗材，仪器设备，检测，结果判定，记录和报告，生物安全，废弃物处理和防止污染措施的相关要求。

本文件适用于细胞及其培养试剂的快速检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件

GB/T19489

实验室安全通用要求

GB/T40365

细胞无菌检测通则

GB/T42077

生物技术核酸靶序列定量方法的性能评价要求qPCR法和dPCR法

GB/T42753

实时荧光定量PCR仪性能评价通则

WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用

3术语和定义

3.1培养试剂

用于细胞培养与冻存，直接接触细胞的试剂。

示例：如基础培养基、消化酶、细胞冻存液、缓冲液、培养添加组分（血清、血清替代物、非必需氨基酸、生长因子、转铁蛋白、谷氨酰胺等）等试剂

以细菌16SrRNA、真菌18SrRNA基因保守序列为扩增靶标，使用通用引物和探针，进行实时荧光PCR反应，采集荧光绘制出的PCR扩增曲线Ct值,根据检测样本和对照的扩增曲线和Ct值判定样本是否存在细菌及真菌污染。

5检测环境

实验操作环境的洁净度宜至少为C级环境中的A级环境。

6主要试剂和耗材

6.1除特别说明外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格,且经过灭菌处理。

6.2核酸提取纯化试剂盒:，应适用于细胞培养过程中培养试剂、质控样品和细胞样品中细菌、真菌的提取，且宜对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌基因组提取样品前处理操作相同。

6.3qPCR预混液

6.4引物和探针

1)分别针对细菌16SrRNA、真菌18SrRNA基因保守序列设计引物和探针序列，且设计原则和目的基因扩增长度应满足GB/T42077的相关要求。引物和探针设计时应充分考虑细菌真

菌种属的覆盖范围。已公开的引用探针序列见附录A与附录B。

2)合成成引物和探针,加双蒸水配制成100μmol/L储备液。

3)如使用多重PCR进行无菌检测时，可通过设置不同的荧光基团标记的细菌探针和真菌探针进行检测。

注：荧光基团的波长范围呈正态分布的，有一定的带宽，不同荧光基团的荧光信号会有一定的交集，因此，在同时选择多个荧光基团时，要注意尽量选择波长差距较大的荧光基

团，避免不同荧光通道之间的互相干扰。

6.5阳性质控：可使用灭活的标准菌株，标准菌株基因组DNA,靶标扩增序列的质粒标准物质或具有同等效果的商品化产品，阳性菌株应在验证合格后使用。

6.6离心管（无菌无酶）

6.7移液枪头（无菌无酶；10μL、200μL、1000μL）

7仪器设备

7.1实时荧光PCR仪：应符合GB/T42753的要求，在计量有效期内，且应含有Taqman探针上荧光报告集团的检测通道，

7.2离心机：转速范围应包含2000r/min~23000r/min

7.3生物安全柜

7.4微量移液器(2.5μL、10μL、200μL、1000μL)。

7.5旋涡振荡器

8检测

8.1取样与样品前处理

8.1.1供试品的检验量可参考《中华人民共和国药典四部》1101无菌检出法的相关要求。

8.1.2取样和制样应满足相应核酸提取试剂盒中说明书中质控和适用性要求。细胞样品可采用去除宿主DNA的前处理，以降低后续提取中过量宿主DNA对细菌、真菌基因组提取与扩增反应带来的干扰。

8.1.3DNA提取过程中所在环境和所使用的试剂虽经过灭菌处理，但不排除细菌、真菌失活后DNA片段的残留。这些DNA残留可能会产生本底扩增，可选用适当的处理方式（如叠氮溴化丙锭法或WS/T230中的光化学灭活法）对核酸提取试剂进行前处理，来降低相关的影响。

8.2对照

8.2.1阳性提取对照：使用含有灭活细菌阳性质控、灭活真菌阳性质控的样本，从样本处理开始，与供试品平行操作后续检测步骤。

8.2.2空白提取对照：以有水或缓冲液代替样本进行提取，与供试品平行操作后续检测步骤

8.2.3阳性扩增对照：以具有良好目的片段扩增性能的核酸溶液（如细菌和真菌的基因组DNA或含目的扩增序列的质粒溶液等）为模板进行扩增的反应。