《植物生物技术》实验五：植物基因组DNA提取.pdfVIP

DNA

一、试验目的

掌握植物基因组DNA提取的原理与基本方法。

二、原理

法提取基因组原理：（，十六基

CTABDNACTABhexadecyltrimethylammoniumbromide

三乙基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在

高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，可通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等

杂质，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

三、试验材料

植物幼嫩叶片

四、器材与试剂

器材：研钵、离心机、2mL离心管、移液器（200uL、20uL、10uL）及配套枪头、5℃水浴锅

试剂：裂解液、：氯仿异戊醇、％乙醇、异丙醇

241/75

五、试验方法与步骤

（一）裂解液的配置

(PH8.0):1L

0.1MTris-HCl（12.44克）；1.4MNaCl（81.81克）；0.02MNaEDTA（7.45克）；2%

2

CTAB（20克）；0.1%DIECA（1克）；2%PVPK-30（20克）

加0.2%β-巯基乙醇后调PH值至8.0。

（二）抽提步骤

1、DNA粗提

（1）取植物幼嫩叶片于研钵中，加入500ul预热到5℃的裂解液，充分迅速研磨。

（2）用剪宽了的200uL枪头将研磨液吸入2mL离心管中。

（3）将离心管置于5°C水浴锅中，水浴30min,每五分钟上下轻轻摇动几次

（4）拿出后等冷却到室温，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），轻轻上下颠倒混匀至

溶液成一相。

（5）室温12000g离心10分钟。

（）用剪宽了的200uL枪头取上清至新管，加入2/3体积冰冷的（-20℃）异丙醇，轻轻上

下颠倒混匀，这时会出现絮状的DNA沉淀。

（7）12000rpm离心5min,弃上清，用1ml75%酒精洗涤沉淀，自然干燥。

1

（）加入，待溶解混匀后放入保存备用。

8100μlddH2ODNA-20°C

（三）DNA纯化

（）取粗制样品，加入至终浓度，反应。

1DNARNase10µg/µl37℃30min

（）加入等体积氯仿：异戊醇（：）抽提，，离心分钟取上清。

224112000rpm5,

（）重复步骤。

32

（4）加入1/10倍体积3MNaAc（pH5.2），2倍体积无水乙醇混匀，室温放置

30min，12000rpm，离心10分钟。

（）沉淀用乙醇洗次，自然风干，加入溶解。

5DNA70%2-330µlTEbuffer

（）取10µlDNA在1%琼脂