重组人表皮生长因子生产工艺的研究.docxVIP

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重组人表皮生长因子生产工艺的研究

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摘要：采用摇瓶培养方式?先通过单因子实验从甘油?乳糖?葡萄糖三种碳源中选出两种效果显著的碳源作为混合碳源。单因子实验确定了乳糖和甘油作为有效的混合碳源?蛋白胨和酵母膏作为有效混合氮源?“四因素三水平”正交实验确定最佳的培养基配方(甘油1.5%?乳糖2%?蛋白胨0.5%?酵母膏1.5%?氯化纳1%)时表达量达到14.8%。同时?最佳的IPTG浓度为1.0m/ml和最佳诱导时间为4h。

关键词:人表皮生长因子;大肠杆菌;单因子

本次实验将先通过平板划线获得单菌落?再通过摇瓶培养确定高效表达菌株?然后通过摇瓶培养确定最佳的培养基碳氮源及其比例。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验仪器和试剂

仪器名称

实验试剂名称

SW－CJ－IFD单人单面净化工作台

IPTG

3K30高速台式冷冻离心机

丙烯酰胺

TGL－16G台式高速离心机

N,N’-亚甲双丙烯酰胺

KDC-160HR高速冷冻离心机

Agar

JJ500电子天平

LB05酵母膏(总氮8.0%)

SKD-01电热恒温培养箱

乳糖

Arium611纯水发生器

玉米浆（总氮3.5%）

BCD－268WA低温冰箱

氯化钠

SHZ-82A恒温振荡器

葡萄糖

MDF-V40865超低温冰箱

蛋白胨（总氮14.5%）

PowerPac-300蛋白电泳槽及电源

氨苄青霉素

1.2实验方法

1.2.1高表达菌株的筛选

1)通过划线平板培养?获得单菌落?挑取单菌落分别接种到3mlLB培养液(含氨苄青霉素100μg/ml)中?37℃振荡培养8h?保种(甘油终浓度10%)?于-80℃冻存作种子菌；

2)菌种按1%比例接种到3ml新鲜LB培养液(含氨苄青霉素100μg/ml)中?37℃?250rpm振荡培养5h(OD600＝0.6-0.8)?取菌液1ml?12,000rpm?离心2min收集菌体作为诱导前样品；

1.2.2培养基筛选

单因子碳源筛选?单因子氮源筛选和正交实验过程：100ml摇瓶?20ml装液量?加20ul氨苄青霉素(100mg/ml)?接种后37℃?200r/min培养?培养5h后（OD600值到0.8左右）取样1ml?离心收集体?-20℃保存。然后加20μlIPTG(1mol/L)诱导,继续培养4h?停止培养?取样1ml离心?收菌体?-20℃保存。

正交实验培养基

试验号

甘油

乳糖

蛋白胨

酵母膏

氯化钠

1

1%

1%

0.5%

1%

1%

2

1%

1.5%

1%

1.5%

1%

3

1%

2%

1.5%

2%

1%

4

1.5%

1%

1%

2%

1%

5

1.5%

1.5%

1.5%

1%

1%

6

1.5%

2%

0.5%

1.5%

1%

高压灭菌121℃?20min。

1.2.3诱导物IPTG浓度对hEGF表达的影响

采用正交实验培养基6作基础培养基?100ml摇瓶?20ml装液量?加20μl氨苄青霉素(100mg/ml)?接种后37℃,200r/min培养?培养5h后（OD值到0.8左右）取样1ml?离心收集体?-20℃保存。然后按下表加IPTG诱导?37℃200r/min继续培养?4h后取样1ml?12000rpm离心2min?收集菌体。15%SDS凝胶电泳分析hEGF的表达量。

1.2.45L发酵罐小试

发酵种子培养：1L摇瓶?200ml装液量。加100μl氨苄青霉素后接种?37℃,200r/min培养10h.

发酵罐发酵：往罐中加入3ml氨苄青霉素?通过蠕动泵补料方式将种子移入发酵罐?维持温度37℃?通过调节搅拌速度和通气量控制溶氧在30%左右。观察pH变化。每隔1h取样?离心?测湿重?保存样品。发酵进入生长期时溶氧持续下降?当溶氧开始回升时?开始补料。湿重至30g/L左右时?加3mlIPTG进行诱导?每隔1h取样待分析。诱导4h后放罐?离心收集菌体-20℃保存。

3结果与分析

3.1高表达菌株的筛选

通过划线平板培养?获得单菌落?挑取单菌落接种到含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中?培养10h?再按2%接种量接种新LB培养基（含100ug/ml氨苄青霉素）中?培养至OD600≈0.6后取样1ml?离心取沉淀保存于-20℃冰箱中?作为诱导前样品。然后加IPTG诱导（终浓度为1mmol/L）4h后取样1ml?离心取沉淀。诱导前与诱导后样品处理后进行15%SDS电泳?