生化实验一 还原糖的测定.pptVIP

**实验一还原糖的测定（3,5-二硝基水杨酸法）掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。一、目的单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。二、原理还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物在540nm处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量和总糖的含量。黄色棕红色三、实验器材1.红薯。2.试管1.5cm×15cm(×8)。3.吸管0.2ml(×2)、0.5ml(×2)、1ml(×5)、10ml(×1)。4.水浴锅。5.电陶炉。6.722型（或7220型）分光光度计。7.容量瓶100ml(×3)。8.量筒、研钵、三角烧瓶、玻璃漏斗。9.电子分析天平。四、实验试剂1.标准葡萄糖溶液（1.0mg/ml）：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，溶于蒸馏水并定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。2.3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：将2.5gDNS和150ml2mol/LNaOH溶液，加到250ml含有90g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加2.5g结晶酚和2.5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，存储于棕色瓶中备用。五、操作1.葡萄糖标准曲线的制作取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度作为纵坐标，各标准液浓度（mg/ml）作为横坐标，作图得标准曲线。（用蒸馏水调零点）管号试剂012345标准葡萄糖溶液/ml00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20DNS试剂/ml2.02.02.02.02.02.0沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温蒸馏水/ml7.07.07.07.07.07.0葡萄糖浓度/mg/ml00.20.40.60.81.0A540nm用EXCEL作图2.样品中还原糖提取和测定准确称取2g红薯，加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2-3次，洗出液也转入三角烧瓶中，于50℃水浴中保温0.5h，不时搅拌，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50ml离心管中，于4000r/min下离心5min，上清转入100ml容量瓶中，沉淀用20ml蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定容至100ml，混匀，作为还原糖待测液。取1ml进行还原糖的测定。**