解脲脲原体基因突变导致对莫西沙星耐药的研究.docx

?

?

解脲脲原体基因突变导致对莫西沙星耐药的研究

?

?

【摘要】目的：研究解脲脲原体（Uu）编码II型拓扑异构酶的基因喹诺酮耐药决定区（QRDR）突变与莫西沙星耐药的关系。方法：对喹诺酮类药物敏感的Uu临床分离株用莫西沙星进行耐药诱导培养，使之产生第一代和第二代耐药突变株。检测莫西沙星对Uu标准株、临床分离株、第一代和第二代耐药突变株的最低抑菌浓度（MIC），并对这些菌株的QRDR进行PCR扩增后测序。结果：第一代耐药突变株均在编码拓扑异构酶IV的基因的QRDR上发生了点突变；第二代耐药突变株则在继承了前代的点突变之后，均在编码DNA促旋酶基因的QRDR上发生了不同的点突变。结论：QRDR的点突变可导致Uu对莫西沙星产生耐药；莫西沙星对Uu的首要靶酶是拓扑异构酶IV。

【关键词】解脲脲原体；莫西沙星；喹诺酮耐药决定区；突变；耐药

【】R342+.2【】A【】2096-0867（2016）10-037-01

解脲脲原体（ureaplasmaurealyticum，Uu）是存在于人类泌尿生殖道的重要条件致病病原体，主要引起泌尿生殖道感染，也可引起附睾炎、宫颈炎和盆腔感染性疾病等生殖道外感染。氟喹诺酮类药物（fluoro—quinolones）是人工合成的抗菌药物，在临床上广泛用于治疗由Uu引起的疾病。喹诺酮通过抑制微生物II型拓扑异构酶活性阻碍DNA复制。II型拓扑异构酶包括DNA促旋酶和拓扑异构酶IV。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株Uu血清型1标准株（ATCC27813）由南华大学病原生物研究所提供；Uu血清型1临床分离株一份，携带者为本院妇产科确诊患者，经药敏试验显示对左氧氟沙星、司帕沙星和莫西沙星均敏感。标本采自其宫颈分泌物。标本的血清型由本院检验科试验后确定。

1.1.2药物莫西沙星（Moxifloxacin）原料粉剂由常州市亚邦医药研究所有限公司提供，按照说明书要求用灭菌蒸馏水溶解，配成2048mg/L的贮藏液，过滤除菌后置-4℃保存备用。

1.1.3试剂基因组DNA提取试剂盒、PCRPfuMix、Marker等试剂由上海生工生物工程技术服务有限公司提供；Uu液体和固体培养基由南华大学微生物学教研室提供。

1.2实验方法

临床株组取Uu血清型1临床分离株在琼脂培养基上划板并培养，然后挑取单个菌落（记作Uu0）用液体培养基培养扩增。测定莫西沙星对增菌产物的最低抑菌浓度（MinimalInhibitoryConcentration，MIC）。MIC的判断标准为在未添加莫西沙星的培养管中出现由红到黄的颜色改变的时间内（在37℃中培养24h），添加了莫西沙星的培养管未出现颜色改变的抗生素的最低浓度，即24h内颜色未改变的最末一管的药物浓度就是莫西沙星对此株Uu的MIC值，之后颜色才发生改变的试管内则含有耐药突变株。待试管内液体培养基颜色不再发生改变后，取其中颜色发生改变且莫西沙星浓度最大的一管在琼脂培养基上划板并培养，然后挑2个菌落（即2个第一代耐药突变株，分别记作Uu1A和Uu1B）用液体培养基增菌。

1.3操作步骤

1.3.1MIC测定方法取15支无菌试管，均加入2ml培养基。将2ml2048mg/L的莫西沙星加入第1管，然后在第1管至第13管中进行倍比稀释。再将2ml1×107ccu/ml的菌液加入第1管至第13管。第14管中加入2ml2048mg/L的莫西沙星作为阴性对照，第15管中加入2ml1×107ccu/ml的菌液作为阳性对照。每次测MIC均采用标准株进行质控。

1.3.2模板DNA的提取方法按照基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

1.3.3引物用PrimerPrimer5.0软件进行设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2实验结果

6份Uu标本相对于莫西沙星的MIC测定结果及QRDR突变情况见表2。

－表示该位点无密码子和氨基酸改变

3讨论

Kim[7]认为，将某药对Uu的MIC为对标准株的MIC4倍以上视为该Uu对该药产生了耐药。对6份标本各自的4段基因的QRDR序列进行比较，并结合莫西沙星对它们的MIC进行分析，本文作者发现，Uu0并未对莫西沙星产生耐药，并且Uu0的QRDR与标准株Uu1一致；而Uu1A、Uu1B、Uu2A和Uu2B的QRDR均有突变，它们对莫西沙星均产生了耐药。因此，可以认为是QRDR突变导致了Uu对莫西沙星的耐药。

综上所述，本文作者认为，QRDR的点突变可导致Uu对莫西沙星产生耐药，莫西沙星对Uu的首要靶酶是拓扑异构酶IV。

Reference：

[1]BiswasS，RaoultD，RolainJM.MolecularmechanismsofresistancetoantibioticsinBartonellabacilliformis.JAn