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两种去除血清高丰度蛋白方法的比较研13600字

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两种去除血清高丰度蛋白方法的比较研究

比较乙腈沉淀法和MERCK公司的血清白蛋白和IgG去除试剂盒去除人血清中高丰度蛋白的效果。方法应用乙腈沉淀法和MERCK公司的血清白蛋白和IgG去除试剂盒对血清样品进行处理，Tricine-SDS电泳和SELDI-TOF-MS检测去除高丰度蛋白的效果。结果乙腈沉淀法能在去除血清高中丰度蛋白的同时收获更多的10kD以下的小分子量蛋白，MERCK公司的试剂盒也能有效地去除血清高中丰度蛋白，特异性较好。结论两种方法均能去除血清中高丰度蛋白，需根据研究目的选择适合的方法。

血清中小分子量蛋白（10kD）认为是一些激素、细胞因子、生长因子以及一些大分子蛋白水解的片段并且在生物学过程中扮演着关键的角色[1,2]，并可能作为疾病的标志物。对肝癌患者血清的检测中，分子量2～10kD的小分子量蛋白，有许多蛋白在肝癌患者血清中高表达，这些蛋白很可能是新的肝癌相关的血清蛋白标志物[3]。对这些差异蛋白分子进行鉴定，将有助于探讨肝癌的发生机制，并为设计治疗靶点提供依据，对蛋白质数据库的进一步完善具有重要意义。

从复杂的血清样品中鉴定出标志蛋白，首先要考虑的问题是血清中蛋白质种类很多，其中有许多丰度较高但没有特殊生物学信息的蛋白质，对目前的蛋白质分离鉴定技术提出了巨大挑战。因此高丰度蛋白的去除和低丰度蛋白的富集己成为血清样品处理中的首要步骤，本研究主要对乙腈沉淀法和Merck公司的去除Albumin/IgG试剂盒法去除血清中高丰度蛋白和富集小分子蛋白的效果进行比较研究。

1材料与方法

1.1实验样品肝癌患者血清：来自广西医科大学附属肿瘤医院住院患者，临床诊断为原发性肝癌患者。

1．2主要试剂与仪器乙腈(ACN)，美国Sigma公司；ProteoExtract?Albumin/IgGRemovalKit,德国MERK公司；丙烯酰铵、N,N′-甲叉双丙烯酰铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基甲基甘氨酸(Tricine)、十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素,AMERSO公司;低分子量蛋白质标准品,上海生工生物工程有限责任公司;垂直电泳槽，Bio-Rad公司；蛋白芯片生物系统（PBSIIC）及CM10芯片购自美国Ciphergen公司。

1．3方法

1．3．1乙腈沉淀法去除血清中的大蛋白将60μl血清加入到120μl的乙腈中，剧烈振荡5s，放置室温30min，样品在室温下14,000g离心10分钟，将上述组分用冻干机浓缩到60μl。

1.3.2ProteoExtract?白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白/IgG,按试剂盒的说明书进行操作。

(1)样品的准备:将60μl血清用10倍的结合缓冲液（600μl）稀释于分离管中。

(2)柱子的预处理:将蓝色的盖子从柱子上拿开，倒置在纸巾上去除贮存缓冲液；拿开底部的接头后，将柱子放入合适的缓冲液收集管；加入0.85ml的结合缓冲液让其通过重力作用流过树脂床。丢弃缓冲液收集管；将柱子放入新的样品收集管。

(3)白蛋白/IgG的去除：将稀释的样品加入柱子并让其通过重力作用流过树脂床。收集流动相，再用600μl的结合缓冲液清洗柱子。让其通过重力作用流过树脂床。收集洗脱液；重复用600μl的结合缓冲液清洗柱子。其通过重力作用流过树脂床。收集洗脱液。这些结合的组分内含有去除白蛋白/IgG的样品。将上述组分用冻干机浓缩到60μl，进行Tricine-SDS电泳分离蛋白和WCX2芯片检测。

1.3.3将收集的两种样品进行Tricine-SDS电泳分离蛋白和WCX2芯片检测。2结果

2.1Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果经去除血清白蛋白ProteoExtract?白蛋白/IgG去除试剂盒和乙腈沉淀法去除高丰度蛋白后的样品经Tricine-SDS-PAGE电泳分离后，凝胶结果（图1）显示，两种方法均能将血清中的一些大分子量和高丰度的蛋白去除，与原血清相比，白蛋白的含量已经明显减少，而且在用乙腈沉淀法处理的样品中，在6.5kD以下还出现一条的小分子量蛋白条带。

M：低分子量蛋白质标准品A：乙腈沉淀法处理后的肝癌患者血清

B：肝癌患者原血清C：白蛋白/IgG去除试剂盒处理后肝癌患者血清

图1两种去除高丰度蛋白方法的比较电泳图

2.2SELDI-TOF-MS检测结果经ProteoExtract?白蛋白/IgG去除试剂盒和乙腈沉淀法去除高丰度蛋白后的样品经SELDI-TOF-MS检测，如图2所示，与原血清相比较，经去除血清白蛋白ProteoExtract?白蛋白/IgG去除试剂盒去除高丰度蛋白后