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镉超富集植物东南景天根系分泌物的代谢组学研究

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镉超富集植物东南景天根系分泌物的代谢组学研究

1引言

代谢组学是研究生物体受刺激或扰动而引起的体内代谢物动态变化的科学sup[1]/sup，广泛应用于疾病诊断、药物研发、毒理学及药物作用机制研究等领域[2～8]。目前，代谢组学检测技术包括核磁共振技术和质谱技术，其中气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）在代谢组学研究中有着非常重要的应用，其方法成熟，灵敏度高，而且有许多数据检索库，有助于代谢物的定性分析。

根系分泌物是植物为了增加营养物质的摄取或适应外界环境的胁迫而通过根系向周围环境分泌的小分子有机酸、氨基酸、脂肪酸、糖等物质，它可通过改变根际土壤的pH值与氧化还原电位（Eh）值、与重金属发生螯合或络合沉淀等化学反应、影响土壤微生物的数量和活性等，直接或间接地影响重金属在土壤中的结合形态及生物有效性sup[9]/sup。目前，对超富集植物根系分泌物的研究主要集中在柠檬酸和草酸等小分子有机酸、总有机物或总有机碳上[10～13]，而对超富集植物根系分泌物的组成成分分析及其在不同处理条件下的变化趋势的研究较少。

本研究应用基于GC-MS技术的代谢组学分析方法，分析镉超富集植物东南景天在不同镉处理条件下其根系分泌物的变化特征，寻找其可能的差异显著的根系分泌物质，通过这些物质的变化趋势来探索镉超富集植物东南景天耐受或超富集镉的可能作用机制。

2实验部分

2.1仪器与试剂

TRACEGCUltra-PolarisQ气相色谱-质谱联用仪（配AI/AS3000自动进样器及Xcalibur1.4工作站，美国ThermoFisher公司）;MG-2200氮气吹扫仪、FDU-1100真空冷冻干燥系统（TokyoRikakikai公司）。

甲醇（色谱纯，Fisher公司）;吡啶（色谱纯，国药集团）;N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamide，MSTFA）、甲氧胺盐酸盐（Sigma公司）;营养液组成物质及CdCl2（国药集团）;实验用水为Milli-Q去离子水。

2.2植物材料和培养方法

以浙江省衢州市古银矿生态型超富集型东南景天为供试植物。选择生长良好、粗细基本一致的植物材料，截取含顶芽的5cm长带叶枝条，用300mL黑色塑料瓶培养。先用去离子水进行预培养（约4天），然后转移至营养液培养（营养液组成参见文献[14]）。培养期间，每4天更换1次营养液，用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCl将营养液调至pH5.5，同时保持24h通气。连续培养16天，待长出旺盛根系后，开始进行Cd处理，设2个Cd水平0和40μmol/L，每个水平重复11次。分别收集处理4和8d后的根系分泌物。

2.3根系分泌物的收集和测定

将东南景天从营养液中取出，去离子水冲洗根系3～5次后放入盛有50mL去离子水的玻璃管（用黑色胶布包住遮光）中，连续收集6h根系分泌液。根系分泌物的预处理、衍生化和GC-MS分析主要参考文献[15，16]的方法。将收集的根系分泌液于真空冷冻干燥机上冻干，用预冷的10mL甲醇将其转移至试管中，氮气吹干，然后加入40μL20g/L甲氧胺盐酸盐吡啶溶液，37℃反应2h，并伴随振荡，最后加入70μLMSTFA，37℃反应30min并伴随振荡。反应完成后，0.45μm滤膜过滤至GC进样小瓶，待GC-MS分析。

GC分析条件：色谱柱ThermoTR5-MS毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm）;色谱柱升温程序：初始温度70℃，保持1min，以1℃/min升至76℃，再以5℃/min升至330℃，并保持10min;进样口温度：230℃;载气、辅助气：均为氦气，纯度为99.999%，载气流速为1mL/min（恒流）;进样方式：不分流进样，不分流时间为0.75min，分流比为50∶1;进样量：1μL。

MS分析条件：Ei离子源，电离电压70eV;离子源温度：250℃;传输线温度：250℃;质谱扫描方式：全扫描，扫描范围为m/z50～600;溶剂延迟时间：3min。

2.4数据分析

GC-MS数据采用AMDIS自动解卷积，并与植物代谢产物数据库Fiehn和GMD比对，对相似度大于70%的化合物予以认定，然后利用MET-IDEA对AMDIS输出结果进行提取和处理，接着将已鉴定的根系分泌物质的峰面积进行标准化（不同处理间同一保留时间化合物的峰面积之比），然后导入统计软件SIMCA-P13.0进行主成分分析（Principal