微工第13章-5层析法.pptVIP

分配系数KdKd=(Ve-Vo)/ViVt=∏R2h/4Vt=Vo+(Vi+Vr)=Vo+VsVe---完全洗脱时的洗脱液体积Vo---层析柱内凝胶颗粒之间空隙的总容积Vi---层析柱内凝胶颗粒内部微孔的总容积Vr---凝胶颗粒基质所占的容积Vi---凝胶内部微孔的总容积Vs---层析柱固定相的总体积二、凝胶层析法常用的凝胶1、天然凝胶琼脂和琼脂糖凝胶（Sepharose）：能分离较大相对分子质量的物质，但它带有大量的电荷，层析时需使用较高离子强度的洗脱液2、人工合成凝胶（1）聚丙稀酰胺凝胶（Bio－GelP）（2）交联葡聚糖凝胶（Sephedex）三、凝胶层析技术1、凝胶柱的制备（1）凝胶的预处理（2）凝胶的装填（3）层析床的检查（4）柱的平衡2、样品和洗脱剂的准备洗脱剂：试剂是分析纯、水是纯水固体样品溶于洗脱剂中，无颗粒3、加样（1）加样量的选择脱盐、缓冲液交换等组分分离时加样体积为床体积的30％，如果要求较高的回收率，则为15％～20％。（2）加样方法样品恰好全部渗入凝胶床，又不致凝胶床面干燥而发生裂缝4、洗脱技术洗脱流速高速涡流扩散严重，导致区带变宽5、样品的检测、收集和处理6、凝胶过滤介质的再生、清洗和储存再生：用1.5～2个柱体积的洗脱剂完成洗脱过程清洗：碱液清洗（0.1～0.5moL/L的NaOH）、乙醇、非离子型去污剂保存：浸泡在抑菌剂的溶液中注意事项：选择合适的凝胶、凝胶溶胀后再使用、注意防腐柱层析分离法的有关装置Pharmacia?KTA层析系统又叫凝胶过滤、凝胶层析、凝胶渗透层析、排阻渗透层析、分子筛过滤等层析的原理“层析谱的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。”——马丁（A.J.P.Martin）（英）层析的分类溶质分配机理的不同：离子交换层析IEC离子交换剂疏水性相互作用层析HIC疏水相吸附剂层析聚焦离子交换剂、等电点反相层析RPC非极性反相介质硅胶羟基磷灰石层析HAP磷酸钙晶体超临界流体层析SFC超临界流体流动相灌注层析POROS聚苯乙烯-二乙烯苯，穿透孔和扩散孔，速度快。凝胶层析的原理将具有分子大小网状结构（孔隙）的凝胶粒子浸渍于某种溶液中时，溶液中的溶质分子凡是比网络孔隙小的都能自由进入凝胶粒子内，大的分子由于不能潜入网格便残留在溶液中，所以将分子大小不同的溶液（如蛋白质和硫酸铵）加入到分离柱中，只有小分子物质（硫酸铵）完全能进入凝胶粒子内，而大分子（蛋白质）则被排阻于粒子外，彼此互相筛分，加入洗液后，溶液在分离柱内向下移动，先流出的洗液中，全部含有大分子物质（蛋白质），后流出的洗液中含有小分子物质（硫酸铵），从而达到分离和提纯的目的。色层分离法基本原理色层分离法基本原理分子筛层析示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：