PCR-RFLP方法检测猪氟烷基因.docx

-

-PAGE1-

PCR-RFLP方法检测猪氟烷基因

陈倩仪

（广东第二师范学院生物系，广东广州510310）

摘要：采用聚合酶链反应结合限制性内切酶技术(PCR-RFLP)检测8头生猪的氟烷基因型，筛查其是否有患猪应激综合征的可能。结果显示：这8头猪中有3头猪的氟烷基因型为阴性纯合子。表明这3头猪的氟烷基因型为HalNHalN，不含有有害的氟烷基因型Haln。本次检测未发现阳性纯合氟烷基因（HalnHaln）及杂合氟烷基因（HalNHaln），得出的氟烷基因频率分布为：HalN100%，Haln0%。

关键词：氟烷基因；PCR-RFLP扩增；琼脂糖凝胶电泳

随着生活水平的提高，人们对猪肉品质的要求也越来越高，猪的肉质问题已引起了消费者和养猪生产者的广泛重视。虽然影响猪肉品质的单个基因可能很多，但目前影响猪肉品质的基本明确的主效基因之一就是氟烷基因（Hal）。氟烷基因又称氟烷敏感基因或猪应激综合症基因，是最早发现的主效基因之一，它是一个不完全显性的常染色体上的隐性基因，该基因阳性纯合子（HalnHaln）一般具有瘦肉率高、生长速度快和饲料报酬低等重要经济性状，但降低了猪肉的品质[1]。这主要是因为该基因的隐性纯合子易产生应激综合症（PSS），而应激综合症是产生PSE肉的直接原因。

猪在应激情况下，如长途运输、屠宰等，会对应激原刺激过度敏感，进而呼吸急促、心跳亢进、肌肉僵直，机体内水、电解质代谢紊乱，甚至突然死亡。PSE肉是猪肉的一种主要的质量缺陷，特点是肌肉呈灰白色，质地柔软，具渗出性或水性[1]。此类肉由于失水而收缩，加工产量低，多汁性差，食用质量一般低于正常质量，大大降低了猪肉的经济价值

[1]。它的发生和发展，给世界各地的养猪生产、猪肉加工和销售造成了巨大的经济损失。在我国，由于高瘦肉率猪种的

引入和利用，PSE肉的发生率也在不断上升。

目前，猪氟烷基因型的检测是通过PCR获得猪HAL基因包含CDS序列第1843位碱基突变点的DNA片段。当HAL基因未发生突变（CC型），即阴性纯合子，HhaⅠ限制性内切酶（酶切DNA序列是：5’GCG↓C3’）可以识别GCGC序列，包含该酶切位点的DNA片段可以被该酶消化；当两条染色体的C碱基完全突变为T时，即阳性纯合子，酶切位点消失，变成5’GTGC3’，不能被HhalⅠ切割；当为杂合子时，HhalⅠ限制性内切酶仍可以将其中一条DNA片段消化。

材料方法

仪器与耗材

不同规格移液器，PCR仪，电泳仪，水平电泳槽，电子天平，药品勺，250mL锥形瓶，称量纸，电炉，凝胶成像系统，恒温水浴锅，不同规格离心机，不同规格一次性Ep管，不同规格一次性Tip头，一次性PE手套，操作板，等。

材料与试剂

实验材料

猪耳组织DNA。猪耳组织于市场购买。

试剂

PCR反应相关试剂：含有镁离子的PCR缓冲液，特定的上下游引物，dNTP，TaqDNA聚合酶，灭菌双蒸馏水。凝胶电泳相关试剂：琼脂糖，100×TAE或者100×TBE缓冲液等，DNA分子量标准，上样缓冲液（6×Loadingbuffer），溴化乙锭（EB）或者替代物。酶切相关试剂：HhalI限制性内切酶，酶切缓冲液，等。

实验步骤

猪基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测

将200mg猪耳组织样剪碎，置于1.5mL离心管中，加入800μL裂解液、25μL蛋白酶K，混合均匀，置于50℃恒温水浴锅中孵育14～20h，直至看不见组织块为止。取出，往离心管中加入400μLTris饱和酚、384μL氯仿、16μL异戊醇，室温振荡10～15min，放入离心机，以12000g离心10min。

离心后，取上清液于1.5mL离心管中，加入700μL（或与上清液体积相当）异戊醇沉淀，轻轻摇晃，直至百色絮状DNA出现，再以12000g离心10min。弃上清液，留下沉淀物，加适量75%乙醇溶解，再加入100μL灭菌双蒸馏水，低温保存备用。

同时，配制1%琼脂糖凝胶备用。用天平称取0.3g琼脂糖，倒入250mL的锥形瓶中，加入30mL的1×TAE溶液，均匀混合后，用电炉加热约3min，使琼脂糖充分溶解，小心取出，等温度降至50～60℃时，加入2μL的核酸染料，摇匀后轻轻倒入到专用槽中，防止气泡出现，并插上梳子。

待凝胶充分凝固后，小心移去梳子，向点样孔中加入1μLDNA溶液与5μL上样缓冲液，同时在其中一梳孔中加入DNA分子量标准。将凝胶块放入电泳槽内，以200V电泳15～20min。将凝胶块取出，置于紫外灯或凝胶成像系统下进行观察或拍照，有