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重组胶原蛋白在生物医药方面的应用

一、引言

胶原蛋白是哺乳动物体内分布最广、含量最多的功能性蛋白，具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物活性，在生物医药、化妆品、食品等行业有广泛应用。但动物胶原蛋白存在供不应求、感染风险等问题，重组胶原蛋白成为研究重点。

二、胶原蛋白的结构

基本组成单位：原胶原，由3条左手螺旋结构的α肽链以平行、右手螺旋形式缠绕，氢键互相咬合形成。

氨基酸组成：具有（甘氨酸XY）n周期性序列，肽链中每3个氨基酸残基中就有一个要经过此三股螺旋中央区，此处空间狭窄，只有Gly能进入。

三、胶原蛋白分类

按发现顺序：分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型等，分子的每种α肽链可分为若干亚型。

按结构复杂性：分为纤维胶原和非纤维胶原，非胶原纤维进一步可分为FACIT族胶原、网状结构胶原、念珠状原纤维胶原、锚定原纤维或纤丝胶原、跨膜区胶原、内皮抑素胶原、具有胶原结构域的其他分子。

四、胶原蛋白的相关疾病

埃勒斯当洛斯综合征（EDS）：与编码Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅻ型胶原链基因的突变有关，血管型最严重，通常由Ⅲ型胶原基因的缺陷/突变引起。

软骨发育不全、骨关节炎（OA）、多发性骨骺发育不良、先天性脊柱骨骺发育不良和Stickler综合征等：与COL2A1基因的致病性变异有关。

Alport综合征：与编码Ⅴ型胶原的基因COL4A3COL4A5中近一半的致病变异致使Gly替换有关。

Bethlem肌病：与编码VI型胶原α链基因COL6A1COL6A3发生变异有关。

营养不良性大疱性表皮松解症（DEB）：与编码VII型胶原的基因COL7A1发生致病变异有关。

交界性大疱性表皮松解症（JEB）：与编码XVII型胶原蛋白的基因COL17A1的致病变异有关。

早发性富氏角膜内皮营养不良：与编码Ⅷ型胶原的基因COL8A2中的p.（Leu450Trp）突变有关。

OA中软骨变性：与肥厚标志物X型胶原的过表达有关。

肿瘤：编码X型胶原的基因COL10A1与肿瘤有关，在胃肿瘤组织中过表达，还可通过促进脯氨酸4羟化酶β亚基在乳腺癌（BC）中起致癌基因的作用。

肝内胆管癌（ICC）：编码Ⅻ型胶原α1链（COL12A1）在ICC中过表达。

Knobloch综合征：与编码ⅩⅧ型胶原（ColⅩⅧ）的基因COL18A1突变有关。

BC：ColⅩⅧ可通过ErbB信号通路维持人类乳腺癌细胞的干性特性以及肿瘤的进展和转移。

肥胖和2型糖尿病：ColⅩⅩⅠⅤα1（ColⅩⅩⅠⅤα1）mRNA在肥胖和糖尿病受试者的内脏脂肪组织中表达增加。

阿尔茨海默病：COL25A1在阿尔茨海默病的淀粉样蛋白发病机制中发挥双重功能，一方面促进APP加工，加速β淀粉样蛋白（Aβ）生成，另一方面与Aβ聚集体结合，减缓Aβ原纤维伸长。

五、胶原蛋白的生产

1.动物源胶原蛋白生产

提取方法：酸法、碱法、酶法及热水法等，超声波技术也已引入，酸法和酶法更为常用。

酸法处理：用酸浸泡原料使其切割胶原交联，在酸性条件下，胶原蛋白分子产生的静电排斥力利于分子之间分离，有机酸更能有效切割胶原交联，改善提取率，但酸法提取一般在极端温度和pH条件下进行，不易控制，水解产物功能性降低。

酶水解：可提供更好的反应选择性，反应条件温和，对胶原蛋白的损害小，对加工设备腐蚀性小，能源消耗和废物产生少，可有效控制水解程度，最终水解产物含盐量低，但胶原的酶解作用可能会降低产物的理化性质，酶残留和失活也可能会造成产物污染。

超声波辅助：酸或酶提取蛋白过程中使用超声波可提高产量并减少提取时间，酶提取过程中使用超声波还可能提高胶原蛋白纯度，但胶原蛋白的产量也受到超声波振幅和持续时间的影响，不适宜的超声频率和时间会造成胶原蛋白结构的损害。

2.重组胶原蛋白生产

（1）生产过程：获取编码基因序列并分析，设计引物，PCR扩增或基因合成，与目的基因不一致则测序，与目的基因一致则进行目的基因和表达载体的限制性酶切，体外转化、扩增，质粒构建失败则进行质粒检测，受体表达细胞的转染，质粒构建失败则进行质粒检测，表达细胞筛选，收集表达产物，验证表达产物，分离纯化表达产物，得到重组胶原蛋白。

（2）表达体系：

动物：动物胶原蛋白活性高，与天然蛋白更接近，但培养基成本高，培养周期长，培养困难，胶原蛋白表达量低，操作技术要求高，产率低，不适合大规模生产。

植物：植物来源广，方便经济，安全性高，但发酵纯化的成本高，产率低，不易产业化生产。

微生物：成本低，遗传信息清晰，生长繁殖速度快，培养周期短，可操作性强，易于产业化，但毕赤酵母体系存在甲醇潜在风险，大肠杆菌体系纯化困难，产物活性低。

六、重组胶原蛋白的应用

1.创口止血及皮肤损伤修复

创口止血：重组III型人源化胶原蛋白凝胶敷料可显著减少出血时间、出血量及肝脏病理损伤；重组I型胶原止血海绵在体内可完全生物降解，无不良反应