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西格列汀延缓或阻止2型糖尿病肾病进展的实验研究
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【摘要】目的：研究西格列汀药品阻止或者延缓2型糖尿病肾病的效果，确定相应进展与可能的机制。方法：通过小剂量链脲佐菌素进行诱导，同时形成高脂饲养条件，以此形成大鼠的DN模型，完全成模之后，分成SIT组与DN组，分别指西格列汀组与模型组，另外还设置对照组为NC组。连续12周对实验对象实施灌胃处理，获取其肾组织，实施检测工作，确定肾脏的实际纤维化程度，通过其他的检测方法对肾组织的表达情况进行确定，最后确定蛋白含量时运用免疫组化法的检测方式。结果：对比对照组，模型组的NF-κB、TLR4与TLR2都有所增加，同时纤维化程度也有所增强，对比西格列汀组与模型组，其相应指标降低。结论：根据本次实验可以确定，西格列汀可对存在DN症状的大鼠体内的肾纤维形成影响，其运行机制极大可能与抑制NF-κB、TLR2与TLR4出现过度活化情况存在关联。
【关键词】西格列汀；2型糖尿病肾病；研究进展；实验
糖尿病肾病具有复杂化的发病机制，经过已有的临床研究材料可知，糖尿病肾病出现与后续发展过程中，炎症可能会直接参与其中。在对这种复杂疾病实施治疗时，可运用西格列汀药品，与其他同类药品相比，该药品能够对患者的神经系统与心血管起到保护作用，同时该药物被运用存在DN病症的实验大鼠上，可减轻其肾缺血与在灌注活动造成的损伤，对于西格列汀治疗DN患者的机制与影响方面的研究相对偏少，本文根据存在同类疾病的大鼠模型展开实验研究，确定西格列汀具体可形成的影响，确定其可能形成的作用机制。
1材料与方法
1.1一般材料
动物：健康SD大鼠30只，雄性，体重(180±20)g，SPF级。
药品：西格列汀，规格：每片100mg；链脲佐菌素，规格：每瓶1g。
仪器：OneTouch血糖仪；GI2200Pro凝胶成像系统。
1.2方法
初期需要形成大鼠DN模型，需要30只性别为雄性的大鼠，随机划分大鼠的组别，高脂组中设置20只大鼠，对照组大鼠的数量为10只。针对对照组中研究对象，主要给予普通的鼠饲料，而高脂组大鼠则接受高脂类饮食。经过4周时间后，两组大鼠需进行禁食，禁食时间为12h，将链脲佐菌素注射给高脂组的所有大鼠，用量为30mg·kg-1，将枸橼酸缓冲液注射给对照组的大鼠，pH值为4.4，注射量需保持与注射对象等体积。
一周后，空腹血糖(FBG)7．8mmol·L-1的大鼠再次腹腔注射30mg·kg-1链脲佐菌素。每周检测一次大鼠FBG，4周后，将两次FBGI7．8mmol·L-1或一次FBG≥11．1mmol·L-1的判为2型糖尿病大鼠。
将存在DN症状的大鼠按照随机分组的方法划分为SIT组与DN组，组中大鼠数量分别为8只与9只，采用不同的处理方式，针对SIT组，需每日用西格列汀药品来进行灌胃，用量为10mg·kg-1，急NC组与DN组大鼠数量均为9只，运用NaCl药品进行同样的灌胃操作，用量为与使用对象等体积。连续进行12周的灌胃活动，每组剩余大鼠的数量均为6只，将其处死之后，获取肾组织，进行后续检测工作。
用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，切片厚度4μm。脱蜡后，用Masson染色，在200倍光学显微镜下观察，细胞呈红色，胶原纤维呈蓝绿色，用Image—ProPlus5．0图像处理系统测量胶原纤维阳性区占所观察视野的面积比。
反转录PCR法检测肾组织Toll样受体(TLR)2、TLR4、核转录因子一KB(NF—κB)mRNA的表达：取总RNA1μg进行反转录PCR反应。用凝胶成像系统对每一标本的PCR产物扩增的特异性片段进行灰度扫描，用TLR2、TIR4、NF—KB的灰度值与β—actin的比值表示目的基因TLR2、TLR4、NF—KB的相对表达量。
免疫组化法检测肾组织TLR2、TLR4蛋白的含量：肾组织石蜡包块制作切片，厚度4m。用免疫组织化学法检测TLR2、TIR4蛋白含量，抗体按1：200的方法稀释，在200倍光学微镜下观察，阳性区出现棕黄色颗粒，用Image—ProPlus5．0图像处理系统测量TLR2、TLR4蛋白的平均积分光密度。
Westernblotting法检测肾组织NF—κB蛋白的含量提取肾组织总蛋白后，定量，取蛋白样本70μI样进行凝胶电泳后转膜，封闭液封闭lh，一抗(1：200)4℃过夜，荧光二抗37℃孵育2h，红外成像系统拍照，以NF—κB的灰度值与B—actin的比值表示NF—κB的相对表达量。
2结果
NC组大鼠肾组织可见少许胶原纤维沉积，DN组大鼠胶原纤维沉积明，SIT组胶原沉积有所减轻。与NC组相比，DN组大鼠肾组织胶原纤维显著增多，差异有统计学意义(P0．01)；与DN组比，SIT组大鼠胶原
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