荆半夏愈伤组织的细胞形态学观察-体细胞胚.docxVIP

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荆半夏愈伤组织的细胞形态学观察

体细胞胚

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论文导读:：习称荆半夏【2】。叶双凤等【4】成功的利用组培时产生的胚性愈伤组织。石蜡切片制作与观察。小块茎？还是先形成体细胞胚再分化成小块茎。

关键词：荆半夏，愈伤组织，石蜡切片，体细胞胚

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半夏（Pinelliaternata（Thunb.）Breit.）为天南星科半夏属植物。以块茎入药，为我国传统中药材，全国20多个省(市)均有分布，主产四川、湖北、贵州、河南、安徽、山东、浙江等省[1]。湖北荆州地区和流经湖北境内的汉水流域所产半夏，以色白、质坚实、粉性足而被誉为上品，蜚声海内外，习称荆半夏【2】。半夏繁殖器官有块茎、珠芽和种子【3】，以块茎繁殖会影响药材产量，以珠芽繁殖因随着半夏植株的倒苗而不易收获，以种子繁殖因其结实率低下而无实际意义。因此，有研究者希望通过组培快繁用于扩大种植，但组培苗的炼苗及移栽成活率低等问题使其推广应用还不成熟，叶双凤等【4】成功的利用组培时产生的胚性愈伤组织，运用激素调控技术，使胚性愈伤组织直接产生小块茎而不形成实生苗（是直接通过器官发生途径形成，小块茎？还是先形成体细胞胚再分化成小块茎，对这一科学问题没有论述清楚？？），以达到半夏人工种茎的工厂化生产，为半夏种源的大规模提供成为可能。了解胚性愈伤组织形成的体细胞胚如何朝着小块茎方向发展，以及细胞形态学变化体细胞胚，这对采取人工控制措施，调节胚性愈伤组织大量形成小块茎至关重要，笔者以取自于湖北省京山县的野生荆半夏为材料，进行了胚性愈伤组织的细胞形态学观察，旨在揭示半夏离体培养体细胞胚的发生规律，探索高频率体细胞胚发生的控制节点，为指导半夏人工种茎的工厂化生产提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验材料

采自湖北省京山县野生荆半夏，由湖北省中医药研究院王克勤研究员鉴定为天南星科半夏属植物半夏中国期刊全文数据库。

1.2愈伤组织诱导及培养

取荆半夏如何界定“幼嫩”？（苗龄？叶的位置？）叶片和茎段（如何获取茎段外植体？）接种于愈伤诱导培养基（MS培养基上附加NAA0.2mg/L，6-BA0.5mg/L，PEG20mg/L，琼脂7g/L，蔗糖30g/L）上，温度27℃，湿度70%，[?]光照强度4000lx进行培养。

1.3石蜡切片制作与观察

选取培养不同时间叶片和茎段的愈伤组织，参照赵俊等【5】方法，用FAA固定液（75%乙醇：冰醋酸=3:1）固定，24h后取出修整使切面平整，置入梯度酒精脱水、浸蜡包埋。切片厚度4μm，番红固绿法染色，自然晾干后用中性树胶封片，显微镜观察并在NICON相机下拍照。

2结果与分析

2.1叶片愈伤组织的诱导及观察

接种3d的叶片表面有膨大迹象并发生卷曲(图1-1)，培养7d时，通过显微切片可以看到叶片表面细胞的细胞质变浓，核仁染色较深位于细胞中央，即表面开始发生细胞脱分化（图1-6），此时的细胞生长旺盛并快速分裂，之后分生细胞分裂形成分生细胞团，大量的分生细胞形成愈伤组织。13d后肉眼即可见愈伤组织(图1-2)，19d时有体细胞胚的生成（图1-7），21d开始长根(图版1-3、4)，29d体细胞胚有出芽迹象（图1-8）。观察发现,愈伤组织大部分产生于叶片表面,内部多为松散的组织。出愈伤的同时，在外植体叶片的表面伴随有胚胎发生，与其余细胞分隔开而形成明显的球形胚。

2.2茎段愈伤组织的诱导及观察

接种6d的茎段切口处发生膨大现象，培养7d后通过显微切片可以看到茎段切口处的愈伤团，11d时肉眼可见愈伤组织，此时茎段切口处已有体细胞胚的形成（图1-10、11）。茎段产生愈伤组织的部位与叶片不同，其愈伤组织的产生主要在切口处，极少数产生于茎段表面。其出愈伤过程首先是切口处细胞启动脱分化，然后形成大量分生细胞团，进而在表层细胞形成体细胞胚（图1-17）体细胞胚，呈球形。

2.3荆半夏胚性愈伤与非胚性愈伤的比较

荆半夏愈伤组织按形态可分为胚性愈伤与非胚性愈伤，胚性愈伤的组织结构紧密，呈翠绿色和绿色（图1-19），其上附着的小颗粒胚在适合的培养基上能直接发育成完整植株，切片观察可发现其细胞小，细胞质浓，细胞核大，染色深，分裂能力强（图1-21），培养一段时间能形成大量的体细胞胚。非胚性愈伤的组织结构疏散，容易分离，颜色偏白（图1-20），分化成苗的能力弱，细胞大，细胞质稀，细胞核小，染色浅，分裂能力弱（图1-22），后期形成体细胞胚的数量极少。偶有胚性愈伤与非胚性愈伤组织同时存在的现象（图1-18）。另外，以叶片诱导的愈伤组织产生的非胚性愈伤组织较多，而以茎段诱导的愈伤组织产生的非胚性愈伤组织较少中国期刊全文数据库。

3结论与讨论

荆半夏叶片和茎段均能诱导产生愈伤组织，以叶片为外植体时，愈伤组织大多发生在叶表面，以茎段为外植体时，愈伤组织