生化实验二 还原糖的测定(3,5-二硝基水杨酸法).pptVIP

实验二还原糖和总糖的测定（3,5-二硝基水杨酸法）掌握还原糖和总糖的测定原理学习还原糖和总糖的3,5-二硝基水杨酸(DNS)测定法。目的原理单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。原理还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物在540nm处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中还原糖的含量。原理黄色棕红色实验器材1、红薯2、试管1.5cm×15cm(×10)、试管1.8cm×18cm(×2)3、吸管1mL(×2)、10mL(×2)4、水浴锅。5、电炉。6、722型分光光度计7、pH试纸（1~14）8、容量瓶100mL(×3)。9、量筒、研钵、三角烧瓶、玻璃漏斗。10、电子天平实验试剂1、标准葡萄糖溶液（1.0mg/mL）：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，溶于蒸馏水并定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。2、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：将6.3gDNS和262mL2mol/LNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，存储于棕色瓶中备用。操作1、葡萄糖标准曲线的制作：取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度作为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）作为横坐标，作图得标准曲线。（比色皿中装2/3液体即可）管号试剂012345标准葡萄糖溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸馏水/mL1.00.80.60.40.20DNS试剂/mL2.02.02.02.02.02.0沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温蒸馏水/mL7.07.07.07.07.07.0葡萄糖浓度/mg/mL00.20.40..60.81.0A540nm用EXCEL作图、求R2和公式2、样品中还原糖提取：准确称取0.2g面粉（或藕粉），加蒸馏水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入100ml三角锥瓶瓶中，并用20mL的蒸馏水冲洗研钵，洗出液也转入三角锥瓶中。将三角烧瓶于50℃水浴中保温0.5h，不时搅拌，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定容至100mL，混匀，作为还原糖待测液。取1mL进行还原糖的测定。操作3、样品中总糖提取：准确称取0.5g面粉（或藕粉），加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入100ml三角锥瓶瓶中，并用15mL的蒸馏水冲洗研钵，洗出液也转入三角锥瓶中。再向三角锥瓶中加入6mol/LHCl溶液10ml搅拌均匀后在沸水浴总水解0.5小时，取出1~2滴置于白瓷板上，加1滴I2-KI溶液检查水解是否完成，如已水解完成则不显蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6mol/LNaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，取1mL进行用于总糖测定。