从马肝脏提取纯化RNA方法的探索.docx

?

?

从马肝脏提取纯化RNA方法的探索

?

?

沙仁高娃

核酸是生物體的基本组成物质，是重要的生物大分子，从高等动物，植物到简单的病毒都含有核酸。核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。RNA是基因表达中间产物，同时也是RNA病毒的遗传物质，对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。RNA分离纯化技术是分子生物学研究中的基本技术，TRIZOL试剂法提取RNA既快速有高效，TRIZOL法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌从几十毫克至几克样品中提取RNA。用TRIZOL法提取的总RNA无蛋白和DNA污染。本实验对TRIZOL试剂法进行改进，目的在于获得快速高效提取马肝脏总RNA的方法，为有关马肝脏RNA分子生物学研究奠定基础。

1.材料与试剂

1.1材料

马肝脏

1.2主要试剂

无RNA酶灭菌水，氯仿，乙醇，TRIZOL试剂，液氮，DEPC水。

1.3主要仪器

冷冻台式高速离心机，研钵，低温冰箱，冷冻真空干燥器，电泳仪，紫外光检测仪，电泳槽。

1.4注意事项

1.4.1全程必须戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的提取并成为RNA酶的来源。

1.4.2使用灭菌的一次性塑料器皿避免使用公共仪器所导致RNA酶交叉污染。

1.4.3在TRZOL中RNA是隔离在RNA酶污染之外而对样品的后续操作要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150度的轰响中烘烤4小时。

2.提取RNA

1.把0.1g肝脏剪碎放入研钵中加入少量液氮.迅速研磨，待组织变软再加液氮，再研磨，这样三次后室温放置5分钟将样品转到2.0ml的离心管中。

2.粉末溶化前加入1mlTRIZOL试剂.混匀。用力振荡15/30s，平放离心管在冰板上5min。在4℃，12000g下离心10min。

3.取上清2ml离心管中，加入与上清等体积的氯仿，上下颠倒混匀。在4℃，12000g下离心10min。

4.取上清1.5ml离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min。在4℃，12000g下离心10min。

5.弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇轻轻洗涤RNA沉淀。在4℃，12000g下离心1min。

6.弃上清，用枪头吸去剩余液体，室温干燥10-15min。加入适量的DEPCH2O溶解RNA。

7.在-70℃保存待用。

8.与TRIZOL试剂说明书相比，改进部分为；第2步的离心为增加的一步；第3步抽提蛋白时氯仿使用量0.2ml增加到1ml；第4步异丙醇沉淀RNA及75%乙醇洗涤RNA沉淀时，试剂经预热。

3.RNA的完整性及质量检测

3.1RNA的电泳分析

RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在1×TAE中进行，琼脂糖浓度为1%，上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔，以5v/cm的电压电泳1.5/2.0h，然后在紫外凝胶成像系统中观察所提取RNA的完整性。

3.2RNA纯度鉴定

开启紫外分光光度计预热稳定30min再用DEPC处理水校正零点。取0.5ulRNA样品用DEPC水稀释100倍。将稀释液转到比色杯中读取260nm。280nm处的紫外光吸收值。计算OD260/OD280用于纯度分析。

4.结果

4.1RNA的纯度检测

用紫外光光分度计测的RNAA260。A280值（表1）；其A260/A280值1。7/2。0间，说明RNA纯度较高。

4.2RNA的质量检测

取0.5ulRNA样品进行非变性琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明28S。18S和5SrRNA带型清晰，从图1中清晰的看到28S。18SrRNA两条主带，跑在最前面的5SrRNA也隐约可见。以上结果说明提取的总RNA纯度较高，无明显降解，符合实验要求（图1）。

5.讨论

本方法从提高RNA产率及减少TRIZOL降解入手。针对TRIZOL操作方法进行优化改良。与说明书提供的操作方法相比不同之处在于。

5.1加入TRIZOL试剂用力振荡后平放试管。使得RNA更易被抽提；异丙醇。无水乙醇沉淀RNA及75%乙醇洗RNA沉淀都经预冷。增加RNA沉淀从而提高RNA产率；

5.2增加了1次高速离心，能更为有效地除去不溶性的蛋白质。多糖。多酚等大分子物质；但减少了分离相离心时间（由15min减至10min）。总提取时间仅延长约5min。在提取RNA的过程中用有机溶剂沉淀RNA沉淀很多。复溶时大量沉淀不溶。本方法所提RNA溶解迅速，说明增加高速离心是一种简单有效除去蛋白质。多糖。多酚等大分子物质的方法。此外。为了更彻底地去除多糖。多酚。也可在TRIZOL抽提后。离心前加入无水乙醇0.1/0.3ml（达到总体积的10%/30%），可增加多糖。多酚及DNA等大分子沉淀。而RNA仍溶解，从而提高RNA的纯度。

5.3在抽提蛋白质时增加了氯仿使用量。由