分子克隆常用的DNA聚合酶课件.pptVIP

分子克隆安普利试剂研发部胡师凯

主要内容（一）.基本概念n（二）.分子克隆技术的基本过程n1.概述n2.分子克隆中常用工具酶n3.基因克隆常用载体n4.目的基因的分离与制备n5.目的基因的体外重组n6.重组子导人宿主细胞n7.阳性重组子的筛选和鉴定n

（一）.基本概念:1.分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。2.Dalton，bp，nt道尔顿（Dalton，Dal，Da，D）：分子量的单位，蛋白质是大分子，所以常用kDa（千道尔顿）来表示。碱基对（bp）＝basepair，1kb就是1000个碱基对；nt＝核苷酸nucleotide。

（一）.基本概念3.保碱基n在分子克隆中，有我会在待增的n目的基因片段两端加上特定的切位点，用于后的切和接反。由于直接暴露在末端的切位点不容易直接被限制性内切切开，因此在PCR引物，人的在切位点序列的5‘端外添加外的碱基序列，即保碱基，用来提高将来切的活性。n

（一）基本概念4.T-A克隆：利用Taq在PCR物3‘末端有加上一个A的特性，使得Taq的PCR物或Taq加A的PCR物，和一个人工加上一个3’末端具有1个T的体行接，由于突出末端可以互，以大大提高目的基因和体的接效率。

（一）基本概念5.RNAH活性：n降解合在DNA上的RNA的磷酸二n。可消化mRNA。6.体：n是指能在接作用下和外源DNA片n段或基因接，并运送DNA分子入受体胞的DNA分子。

（一）基本概念7.质粒(plasmid)n细菌染色体外的遗传物质，为环形闭n合的双股DNA，存在于细胞质中，质粒编码非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。

（一）基本概念8.F因子n又称致育因子或性因子。是E.coli等细菌中决定性别的质粒，约等于2%核染色体DNA的小型共价闭合环状DNA（cccDNA通过共价键结合形成的封闭环状nDNA分子。）。分子量为6.2×10Da，794.5Kb。其中有1/3的基因（tra区）与接合作用有关。

（二）分子克隆的基本过程1.概述nnn（1）.分：得到目的基因（2）.切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割。（3）.接：将目的基因和载体连接，形成重组子。nnn（4）.转：将重组子转到适当的宿主细胞中。（5）.筛：筛选出含有正确重组子的宿主细胞，扩增。

（二）分子克隆的基本过程2.分子克隆中常用工具酶分子克隆中对DNA、RNA分子的操作常涉及到一系列酶促反应，这些酶是进行基因克隆时必备的基本工具。

分类（1）.使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶。（2）.催化核酸合成的酶类：DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。（3）.核酸修饰酶类；甲基化酶，激酶，基团转移酶，磷酸酶等。

（1）.使核酸降解的核酸酶类：Ⅰ.限制性核酸内切酶概念的提出及背景：20世纪30年代初，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染。如E.coliK株的噬菌体只能感染E.coliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象成为——限制现象。但某些被菌体限制的噬菌体群中，有少数能幸存下来，并在菌体中繁殖，这种现象称为——修饰现象。

Ⅱ.限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease，RE)的定义是由细菌自己产生的一种能识别双链nDNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。

Ⅲ.限制性核酸内切酶的分类：按照限制性核酸内切酶对辅助因子的需求与否，以及切割DNA链的特点，将已发现的限制性内切酶分为3种类型：I、Ⅱ、Ⅲ型。

Ⅱ型限制性内切酶实际应用价值最大，这是因为：①Ⅱ型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性；②对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；③此类酶作用时只需要Mg2+参与。无需ATP。因此Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。

Ⅳ．限制性内切酶的命名目前已广泛采用H．O．Smith和D．Nathams于1973年提出的命名系统：限制性内切酶第一个大写字母——来自细菌的属名(genus)，第二、三个小写字母——来自种名(species)，第四个字母代表菌株(strain)：如果从一种菌株中发现了多种限制酶，则根据发现和分离的顺序用罗马字母表示。例如从流感嗜血杆菌D株中分离到的限制酶分别表示为Hin