分子克隆的工具酶课件.pptVIP

§切割位点可为获得DNA的物理图的特殊的标记§利用限制性内切酶切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能§获得的限制性DNA片段可作为DNA操作中的基本介质

任何物种都有排除异物保护自身的防御机制免疫系统细菌的限制与修饰系统限制性内切酶修饰酶

第一节限制性内切酶Restrictionendonuclease

一、限制与修饰Restrictionandmodification50年代初，发现hostcontrolledspecificity?噬菌体具有代表性和普遍性其在不同宿主中的转染频率，?在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时受到限制的现象。

E.coliKE.coliBE.coliC?K?B?C

E.coliKE.coliBE.coliC?K?B?C110-4110-41110101-4-4

说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA10-4的存活率是由宿主修饰系统作用的结果甲基化：AN6甲基-腺膘呤C5’甲基-胞嘧啶

2.限制酶的发现60年代，限制内切酶和限制酶的概念1968年首次从E.coliK中分离限制性内切酶需要ATP，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等有特定的识别位点但没有特定的切割位点切割位点远离识别位点1000bp以上

1970年美国约翰·霍布金斯大学H.Smith偶然发现流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌体DNA细胞提取液可降解E.coliDNA但不能降解自身DNA即HindII酶

5’...GTPyPuAC...3’3’…CAPuPyTG...5’GTCGACGTTAACPy表示嘧啶，Pu表示嘌呤GTCAACGTTGACYR

5’...GAATTC...3’3’…CTTAAG...5’EcoRI

3.限制酶的命名?宿主属名第一字母、种名头两个字母?菌株或型号?序号罗马字HindIIEcoRI

例如：HindⅢHaemophilusinfluenzae（流感嗜血杆菌），ｄ：表示菌系为ｄ型血清型；Ⅲ：表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIEcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上HindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromogenesI(Ⅱ)

4、限制性内切酶的分类：第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）：如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000)，作用时需ATP、Mg++等辅助因子第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）：如EcoRI(大肠杆菌)、HindⅢ(嗜血杆菌)，分子量较小(约20000-100000)，作用时需Mg++存在III类识别位点严格专一（不是回文序列）：切点不专一，往往不在识别位点内部。NEB；Invitrogen公司；promega普洛麦格；TakaRa.

二、限制酶的识别序列1、限制酶识别序列长度4，5，6个碱基对。4碱基酶识别位点在DNA分子中的频率6碱基酶稀有切割限制酶2、识别特定碱基顺序：2、1回文对称序列（palindrome，从两个方向阅读其序列相同的序列）。

R=AorGY=CorTM=AorCK=GorTS=CorGW=AorTH=AorCorTV=AorCorGN=AorCorGorTB=CorGorTD=AorGorT

EcoRI5’-GAATTC-3’CC↓TCAGC3’-CTTAAG-5’GGAGT↑CGBbvcI3、Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式切点大多数在识别顺序之内限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

三、限制酶产生的末端种类1.粘性末端１）３’-端突起，２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸

2.平末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’在对称轴上同时切割DNA的两条链HaeIIIGG↓CCEcoRVGAT↓ATCXmnIGAANN↓NNTTC

3.非对称突出端①来自非对称识别序列CCTCAGCBbvCIGGAGTCG

②简并序列AccIGT/MKACGTATACGTAGACGTCTACGTCGAC

③间隔序列DraIIICACNNNGTGEarICTCTTC(1/4)GAGAAG

4.同裂酶1.