DNA样品制备方法 沉淀法 .docx

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T/SHAIAXXXX—XXXX甲基化分析中的DNA样品制备方法沉淀法

1范围

本标准规定了组织和培养的细胞等生物样本中DNA甲基化分析的样品制备方法。本标准适用于从组织和培养的细胞中提取DNA用于甲基化分析。

2规范性引用文件

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国家标准或国际标准

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

DNA甲基化（DNAmethylation）是基因表达调控的一种重要机制，是在不改变DNA序列的前提下对基因组DNA进行甲基化修饰。

4原理

DNA甲基化检测可以采用的方法比较多，PCR法是比较是比较简单易行的方法之一。原理是利用亚硫酸氢盐处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶在转化过程中保持不变。转化后，DNA的甲基化情况可以通过PCR扩增或DNA测序来判定。

在PCR法检测中DNA的纯化最常用的的方法是沉淀法。除上述比较经典的沉淀法以还有有物理的方法：如玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法。化学方式如异硫氰酸胍法、碱裂解法。生物方式如酶法，根据核酸分离纯化方式的不同有硅质材料、阴离子交换树脂等。

沉淀法是在去污剂的作用下将细胞裂解，然后在细胞裂解也中加入SDS加速细胞破碎，再加入酒精将DNA沉淀，采用蛋白酶K和氯仿/异戊醇去除蛋白质，得到纯化的DNA。

5仪器设备

5.1高速台式离心机，

5.2高速冷冻离心机，

5.3紫外可见分光光度计，

5.4紫外及化学发光凝胶成像仪。

5.5超纯水系统

5.6可调移液器，（0.5~10μl,10~200μl,100~1000μl,）

6试剂和材料

6.1.细胞裂解液（10mMTris-HClpH8.0，0.01MEDTA，0.5%SDS），6.2.纯净水ddH2O，电阻率18Ω（分子生物学级）

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6.3.乙醇（75%和100%）（分子生物学级），

6.4.苯酚（分子生物学级），6.5氯仿（分子生物学级）。

7样品

7.1样品来源：甲基化检测的样品可以来源于血液、冷冻组织样本或石蜡组织块。用于甲基化分析的

样品应采用冷冻和其他适当的方法保存良好以防样品降解。

7.2样品处理：采用细胞裂解液或其他适当的试剂提取细胞和组织中的DNA，进一步将DNA与蛋白

质和其他杂质等分离并采用苯酚-氯仿或其他适当的方法如沉淀法等纯化DNA，纯化后的DNA经95%或100%酒精再次冲洗沉淀，获得的DNA沉淀采用纯净水再次溶解备用。

8DNA样品制备

试剂配制

细胞裂解液：10mMTris-HClpH8.0，0.01MEDTA，0.5%SDS。

9DNA样品分析

DNA纯度检测一半采用分光光度法在波长260nm对其进行检测，同时可以通过测定DNA样品在260/280（A260/A280）的紫外吸收值估算DNA的纯度，其比值在1.8为纯度较好，其比值高于2.0预示着样品中有RNA没有除尽。同时也可以采用凝胶电泳的方法检测DNA的纯度，并检测样品中是否有RNA存在。

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附录A（资料性）

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核酸提取方法主要包括以下几种：

1、沉淀法。通过采用细胞裂解液破坏细胞结构来释放核酸，采用化学试剂将细胞中的DNA提取出的方法。

2、化学试剂法。利用核酸和杂质在水和有机溶剂中的溶解度差异进行分离提纯。该方法使用异硫氰酸胍和乙醇/异丙醇来沉淀水相中的核酸。

3、柱纯化法。利用二氧化硅材料吸附原理，在高盐浓度下，通过带正电荷的二氧化硅柱膜和带负电荷的核酸之间的亲和力，使核酸被富集于二氧化硅基质，其他杂质被清除。

4、磁珠法。利用磁珠与核酸的特异性结合，通过磁场作用进行分离。

此外，还有吸附材料结合法，如硅质材料、阴离子交换树脂和磁珠，这些方法利用核酸与吸附材料之间的特异性结合进行分离。每种方法都有其特定的应用和优势，选择哪种方法取决于实验的具体需求和条件。

沉淀法提取DNA：从组织或培养的细胞中分离DNA

1.将组织切成小块，培养的细胞直接进行下一步。

2.加入提取缓冲液（10mMTris-HClpH8.0，0.01MEDTA，0.5%SDS），充分混合，加入RNaseA至最终浓度20ug/ml，在37℃下孵育1小时。

3.加入蛋白酶K至最终浓度100ug/ml，充分混合，在5