分子克隆工具酶—限制和修饰课件.pptVIP

分子克隆工具酶——限制和修饰(restrictionandmodifying)周口师范学院生命科学系

进行基因工程操作，首先要获得需要重组和能够重组的DNA片段。（如何获得？）用相应的酶进行切割，就可以获得含有完整基因片段、复制起始位点、转录启动子或转录区等具有特定功能的DNA片段。那么，如何将需要的DNA片段切割和连接呢？

1限制酶的发现20世纪30年代初发现噬菌体在不同菌株之间的限制现象与不受限制现象，60年代提出对上述现象解释的假设:内切酶能识别并切断外源DNA的某些位点使其失活而限制外来噬菌体的繁殖，属限制酶类。

λ噬菌体不同感染株对E.coli不同菌株的感染率λ噬菌体感染率E.coli菌株λ（K）λ（B）λ（C）KBC110-410-410-41110-411

说明：K菌株和B菌株中有一种限制系统，可以排除外来的DNA。C菌株不能限制来自K菌株和B菌株的DNA。这种限制作用就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。

限制酶的功能：降解外源DNA，从而阻止其复制和整合到宿主细胞中。修饰酶的功能：对自身某个碱基进行甲基化，从而保护自身的DNA不被降解。

?核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。?核酸内切酶：从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片断。?核酸外切酶：从核酸分子的末端开始逐个地切割降解核苷酸。

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease）：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。

2限制酶的分类:根据其识别和切割序列的特性，催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类。广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。

1968年，从E．ColiK株发现限制酶能降解非同源DNA，但切口少，不能产生专一性切口，归类为I类限制酶。1970年，从流感噬血杆菌中分离到一种限制酶，对DNA的切割有一定的切口，要求特异的识别序列，很快被用于DNA结构与功能研宄，是II类限制酶．

特性I型酶II型酶III型酶双能酶内切酶与甲基化酶分离限制和修饰双功能酶识别位点非对称序列回文对称结构非对称序列在距识别位点至1000bp处随机切割距识别位点24–26bp处切割位点识别位点上是序列特异性切割否是分子克隆中应用无广泛很少

3限制酶的命名原则第一个字母，大写，来源宿主属名的第一个字母；第二、三个字母，小写，取自种名的头2个字母；第四个字母，大写，取自它来源菌株系；最后用罗马数字大写，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前3个字母斜体

例：E.coRIE为大肠杆菌的属名(escherichia)的第一个字母co.种名(coli)的头两个字母R表示所用大肠杆菌的菌株I表示该细菌中分离出来的这一类酶的编号E．ColiRyel3株分离到EcoRI,EcoRII，EcoRV

4限制酶识别序列限制酶在dsDNA上能够识别的特殊核苷酸序列。E.coRIGAATTCHindIIIAAGCTTSau3AGATCDraIIPuGGNCCPyPu代表A或GPy代表T或CN代表任意碱基

偶数核苷酸组成的识别序列，以中线为轴，两侧核苷酸互补对称。E.coRIGAATTCCTTAAG奇数核苷酸组成的识别序列，以NN为轴，两侧核苷酸互补对称。GTNACCANTG

根据识别序列的规律性，找可能的识别序列。偶数序列，先找GC、CG、AT、TA，然后找其两侧的核苷酸。NGCNNCGNNATNNTAN奇数序列，先找GNC、CNG、ANT、TNA，然后找其两侧的核苷酸。NGNCNNCNGNNANTNNTNANN代表任意碱基。

一般说，在同一个DNA分子中，识别序列短的出现的概率大，反之概率小。原则上有n个碱基的识别序列的出现概率是1/4n。如Sau3A识别序列GATC，间隔256(44个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列。)E.coRIGAATTC？？

在一个环状DNA分子上，若某种限制酶有n个识别序列，经完全酶切后产生n个DNA片段。在一个线性DNA分子上，若某种限制酶有n个识别序列，经完全酶切后产生n+1个DNA片段。

富AT的识别序列在富AT的DNA分子中出现的概率高，在富GC的DNA分子中出现的概率低。富GC的识别序列？？出现概率低的限制性核酸内切酶称稀切酶(rarecuttingenzymes)。

有的限制酶可识别两种以上的核苷酸序列。例：AccIGTATACGTCGACDdeICTAAGCTTAGCTGAGCTCAG

5限制酶产生的末端切割位点：DNA在限制酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的