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饲料中蛋白质水解氨基酸含量的测定
一、实验目的
1.掌握饲料中蛋白水解氨基酸的测定方法及原理。
2.掌握饲料中蛋白质水解氨基酸的样品制备方法。
3.了解全自动氨基酸测定仪的分析原理及工作流程。
4.了解氨基酸测定结果的影响因素。
二、实验内容
采用全自动氨基酸分析仪应用茚三酮显色法测定饲料样品(豆粕、玉米、配合饲料)
中蛋白质水解后氨基酸的含量。
蛋白质水解法适于含动植物蛋白的单一饲料、配合饲料、浓缩饲料和预混料中氨基酸
的测定,包含常规酸水解法、氧化酸水解法和碱水解法。氧化酸水解法主要用于测定含硫
氨基酸,碱水解法只适于测定色氨酸。普通酸水解法会破坏色氨酸和部分破坏含硫氨基酸,
适于测定除色氨酸、含硫氨基酸(胱氨酸和蛋氨酸等)以外的蛋白水解氨基酸,使用最广,
本实验将采用该样品预处理方法。
三、实验原理
蛋白质由氨基酸聚合而成,其中氨基酸的测定需先水解成单一氨基酸。由于多数氨基
酸不含特征发色基团(除Tyr、Try、Phe含苯环有紫外吸收),氨基酸的分析依赖于衍生
化反应。混合氨基酸经过离子交换树脂分离,依次发生显色反应后,由分光光度计测定吸
光度,采用外标法定量。
1.氨基酸分离原理:氨基酸的洗脱顺序主要取决于各氨基酸的等电点(酸性氨基酸pI
2.8-3.2,中性氨基酸pI5.0-6.3,碱性氨基酸pI7.6-10.8)。所有氨基酸在pH2.2
以下都带正电荷,被带负电的阳离子树脂吸附,但吸附程度不同:碱性氨基酸结合力最强,
其次为芳香氨基酸和中性氨基酸,酸性氨基酸结合力最弱。当洗脱液的pH值逐渐升高时,
原来带正电荷的酸性氨基酸先失去正电荷从树脂洗脱下来,此时中性氨基酸和碱性氨基酸
仍与树脂结合的紧,需要更高的PH值洗脱液才能将它们洗脱下来。另外,洗脱顺序还与
分子极性和分子大小有关,具有短侧链的氨基酸比长侧链的氨基酸先洗脱下来,支链增加
洗脱越容易,侧链羟基化氨基酸优先洗脱下来。综合如下表1:
表1.PH型色谱柱分离17种氨基酸出峰顺序
名称缩写
支链等电点R基分子量
1
天冬氨酸Asp
酸性2.85-CH₂-COOH133.1
苏氨酸Thr
亲水性5.6-CH(CH₃)-OH119.12
丝氨酸Ser
亲水性5.68-CH₂-OH105.09
谷氨酸Glu
酸性3.15-(CH₂₂147.13
)-COOH
脯氨酸Pro
疏水性6.3-C₃₆115.13
H
甘氨酸Gly
亲水性6.06-H75.07
丙氨酸Ala
疏水性6.11-CH₃89.09
半胱氨酸Cys
亲水性5.05-CH₂-SH121.16
缬氨酸Val
疏水性6-CH-(CH₃₂117.15
)
甲硫氨酸Met
疏水性5.74-(CH₂)-S-CH₃
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