放射线照射引起胶质瘤细胞细胞周期和凋亡的动力学变化及其对Chk1-2蛋白表达的影响.docx

?

?

放射线照射引起胶质瘤细胞细胞周期和凋亡的动力学变化及其对Chk1/2蛋白表达的影响

?

?

放射线照射引起胶质瘤细胞细胞周期和凋亡的动力学变化及其对Chk1/2蛋白表达的影响

?放疗在胶质瘤临床治疗中占有举足轻重的地位，放疗的疗效好坏很大程度上取决于DNA损伤检测点的功能状态。目前国外研究多采用同步化处理的肿瘤细胞来建立G2/M阻滞模型[1]，本研究采用更能真实反映细胞内在生物学特性的非同步化的肿瘤细胞，研究放疗作用下，胶质瘤细胞的细胞周期和凋亡的内在动力学变化并讨论放射线损伤对Chk1和Chk2蛋白表达的影响，以了解胶质瘤细胞中Chk1和Chk2对照射后细胞周期的调控作用。

1材料与方法

1.1细胞系培养及照射本课题采用人胶质母细胞瘤U251细胞株，由武汉大学典型物保藏中心提供。在37℃恒温培养箱内对U251细胞进行复苏、培养至对数生长期，再进行传代。将5×105细胞接种于6孔板中，室温下采用瑞典Elekta公司SLi型直线加速器，250Gy/min6MVX线照射分别给予6、10、15Gy三种剂量的照射。于6、12、24、48、60h收获细胞和上清，800r/min离心5min，加入75%冰乙醇1ml固定，-20℃保存。

1.2方法

1.2.1流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率(PI法)取出固定的细胞，制成单细胞悬液，离心洗涤后加入75%的冰乙醇1ml固定过夜。再次洗涤离心后加入500μl染液(240μlPBS、10μlRNase(1mg/ml)、250μl碘化丙锭(50μg/ml)(propidiumiodide，PI))，室温避光孵育20min，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。

1.2.2Westernblot法检测Chk1、Chk2蛋白表达量收集的U251细胞，裂解后离心，将上清转管后于-80℃冻存，采用Bradford方法测定Chk1/2蛋白质浓度。收集的蛋白质样本采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别检测Chk1/2蛋白及磷酸化的Chk1-S345及Chk2-T68蛋白的表达量。

1.3统计学处理统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，P0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1U251细胞株细胞周期和凋亡的动力学特点人胶质瘤细胞系U251经过6Gy的射线照射后，引起的G2/M期阻滞较弱，当剂量增加至10Gy，照射24h后引起非常显著的G2/M期阻滞，达77.35%，并在一定范围内呈现明显的时间依赖效应和剂量依赖效应(见图1)。

随着时间延长(24h后)，阻滞于G2/M期的细胞开始释放，一部分细胞继续进入细胞周期，而另一部分细胞走向凋亡，表现为细胞凋亡明显增加(见图2)。而当剂量增加至15Gy时，没有出现明显的细胞周期阻滞现象，而直接表现为凋亡的增加。

时间(h)

图1U251细胞照射后细胞周期阻滞趋势示意图

时间(h)

图2U251细胞照射后细胞凋亡趋势示意图

2.2Westernblot法检测U251细胞照射后Chk1和Chk2蛋白的表达接受不同剂量射线照射后，U251细胞中Chk1、Chk2蛋白表达水平与未照射相比均无明显变化。采用磷酸化抗体检测发现，照射前后Chk1-S345无明显磷酸化；但照射后6h，Chk2-T68即出现明显的磷酸化，12h达到峰值，24h后Chk2-T68磷酸化水平开始下降，至60hChk2-T68磷酸化水平已基本趋于正常，但Chk2-T68磷酸化水平与照射剂量无关，6Gy与10Gy照射后相同时间点Chk2-T68磷酸化水平无明显差别(P0.05)。见图3。

A

图3Westernblot法检测照射后Chk1/2蛋白表达

注：A：不同剂量射线照射24h后Chk1、Chk2、Chk2-T68蛋白表达；B：10Gy射线照射后Chk2-T68磷酸化水平随时间变化量

3讨论

在长期进化过程中，机体形成了一套防止DNA发生损伤/错误的细胞周期监控机制，使机体遗传信息能够准确无误地传递到子细胞，这一套监控机制统称为DNA损伤检测点。在放疗条件下，DNA损伤检测点的激活，有利于肿瘤细胞DNA损伤/错误的修复，客观上为细胞的生存提供了条件，本质上是一种细胞的自我保护程序[2]。

本研究发现，U251细胞株在正常培养条件下主要处于G1/G0期，这与体外培养的其他哺乳动物细胞生长特性相似[3]。对胶质瘤U251细胞株进行射线照射处理后建立了U251细胞G2/M期的细胞周期阻滞模型，发现10Gy射线照射24h后引起非常显著的G2/M期阻滞，并在一定范围内呈现明显的时间依赖