分子荧光分析讲义课件.pptVIP

分子荧光分析法在医学检验中的应用

发光分析是受激物质分子或原子以发射辐射的形式释放能量，测量的是物质分子或原子自身发射辐射的强度，属于发射光谱法。发光分析法包括荧光分析法，磷光分析，原子荧光分光光度法和化学发光分析。分子吸收了光能而被激发到较高能态，在返回基态时，发射出与吸收光波长相等或不等的辐射，这种现象称为光致发光，分子荧光分析是基于这类光致发光现象而建立起来的分析方法。

基态分子受一激发光源的照射，被激发至激发态主要特点：后，在返回基态时发射出波长与入射光相同或较长的光，称1.灵敏度高：检出限为10-4~10-6g/L。较紫为荧光。一种物质分子能否发射出荧光取决于它本身的分子结构和它所在的环境条件。外-可通常见所分指光的荧光光度是法指紫高外1-~可3见个光数荧量光，级即。利用某些物质受到紫外-可见光照射后，发射出比吸收的紫外-可见光波长2.选择性强：能吸收光的物质并不一定能产光更长或相等的紫外-可见光荧光。通过测定物质分子产生的荧光强度进行分析的方法称为分子荧光分析。生荧光，且不同物质由于结构不同，虽吸收同一波长的光，但产生的荧光波长也不尽相同，所荧能光吸分收析的可紫应外用-可于见物光质波的长定不性同及，定所量发，射由的于荧物光质波结长构也不不同，利用这个性质可鉴别物质。对于同一物质的稀溶液，同。其产生的荧光强度与浓度呈线性关系，利用这个性质可以进3.用样量少、操作简便。行定量测定。

02以10-9~10-7s左右1*跃迁子至回低到能基级态上的。此各过生。

任何荧光物质都具有两个特征光谱，即激发激发光谱:如果将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下荧光强度的变化，以激发波长（λ）为横坐标，荧光强度（I）为纵坐F荧光光谱:固定激发光波长和强度，而让物质发出的荧光通过单色器测定不同波长的荧光强度。以荧光的波长（λ）为横坐标，荧光强度（I）为F纵坐标作图，便得荧光光谱。硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱

①物质必须具有能吸收一定频率紫外光的特定结构；②物质分子在吸收了一定频率的紫外能之后，Fφ=发出荧光的量子数/吸收激发光的量子数F荧光效率越高，荧光的发射强度越大，无辐射跃迁的几率就越小。当荧光效率等于零时就意味着不能发出荧光。因此荧光物质必须具有较大的荧光效率。

大多数荧光物质都具有芳香环或杂环，因为这些化合物都具有易发生π→π或n→π跃迁的电子共轭结构，**π电子的非定域性越大，就越容易被激发，分子的荧光效率越大，因此凡能提高π电子共轭程度的结构，如对-苯基化、间-苯基化、乙烯化的作用都会增大荧光的强度。2与π电子体系互相作用较小的取代基。如-SOH对分子荧光影响不明显。3吸电子基团如-COOH、-CO减弱甚至破坏荧光。

刚性的不饱和的平面结构具有较高的荧光效率，分子刚性及共平面性越大，荧光效率越高，酚酞和荧光素比较，荧光素中多一个氧桥，使分子的三个环成一个平面，其共平面性增加，使π电子的共轭度增加，因而荧光素有强烈荧光，而酚酞的荧光很弱。荧光素酚酞

温度的影响：温度改变并不影响辐射过程，但非辐射去活的效率将随温度升高而增强，因此当温度升高时荧光强度通常会下降。溶剂的影响：随溶剂极性的增加，荧光物质的π→π跃迁几率增加，荧光强度将增加。溶剂*粘度减小，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁几率增加而使荧光强度减弱。若溶剂和荧光物质形成氢键或溶剂使荧光物质的电离状态改变，则荧光波长与荧光强度也会发生改变。

当荧光物质是弱酸或弱碱时，溶液的pH对荧光强度有较大影响。因为弱酸或弱碱在不同酸度中，分子和离子的电离平衡会发生改变，而荧光物质的荧光强度会因其离解状态发生改变。以苯胺为例：在pH7~12的溶液中会产生蓝色荧光，在pH2或pH13的溶液中都不产生荧光。

校准曲线法：以已知量的标准物质，按试样相同方法处理后，配成一系列不同浓度的1.校准曲线法：标准溶液，在仪器调零后再以浓度最大的标准溶液作基准，调节荧光强度读数为100；然后测出其他标准溶液的相对荧光强度和空白溶液的相对荧光强度；扣除空白值后，以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线；然后将处理后的试样配成一定浓度的溶液，在同一条件下测定其相对荧光强度，扣除空白值后，从校准曲线上求出其含量。

分子荧光分析法在医学检验中的应用尿中色胺的含量是色氨酸代谢的一个标志。色胺有天然荧光，激发峰285nm，荧光峰360nm。把尿或组织液的色胺萃取出来，就可直接检测。在0.1~8μg/15mL范围内，荧光强度与色胺浓度呈线性关系。

2维生素B（核黄素）在430~440nm蓝光照射下2会发出绿色荧光，λ为535nm。它在pH6~7的溶em液中荧光强度最大，而在pH11时荧光消失；但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在