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免疫荧光技术--第1页

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：

1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS（1：1）。条件许可，建议购

买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

二、注意事项

1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2、每次试验均需设置以下三种对照：

（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物；

（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物；

（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

三、免疫荧光双标的经验之谈

1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则

是不同荧光信号标记的，我用的是donkeyanti-rabbit-FITC（绿）和donkeyanti-rat-Tex-Red

（红）。

2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸

索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。

3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记

物对照是PBS+荧光标记物。

4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。

5、其余事项同免疫荧光单标操作。

免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化：

不同的是

1免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同

2免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定

3二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察

4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS（1：1）

5条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久

6荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光

87荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照

注意事项

1.荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。

2.每次试验时，需设置以下三种对照：

（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物

（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物

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（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

1、问：用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？

参考见解：只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。

2、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项？

参考见解：我正在做冰冻组织切片的免疫荧光双染。我的经验是：

（1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是don

keyanti-rabbit-FITC（绿）和donkeyanti-rat-Tex-Red（红）。

（2）我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较

好，背景比较清晰。