溶血性曼氏杆菌诊断技术规范.docxVIP

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溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范

1范围

本文件规定了溶血性曼氏杆菌病的诊断技术。

本文件适用于牛、羊饲养场(户)和动物诊疗单位对牛、羊临床样本和分离培养物中溶血性曼氏杆菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3术语与定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Mh：溶血性曼氏杆菌（Mannheimiahaemolytica）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

bp：碱基对（basepair）

dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphates）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

TSA：胰蛋白胨大豆琼脂（trypticsoyagar）TSB：胰蛋白胨大豆肉汤（trypticsoybroth）

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）

ELISA：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay）

5流行病学

由溶血性曼氏杆菌引起的牛、羊呼吸道疾病一年四季均发，秋冬季多见。

6临床诊断

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6.1临床症状

发病牛、羊主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、流涕，并伴有体温升高、精神沉郁、厌食等。发病初期动物呼吸速率加快，继而出现严重的呼吸困难，呼吸伴有啰音。

6.2病理变化

临床病理变化以纤维素性渗出性肺炎、大叶性肺炎和胸膜肺炎为主。剖解后可见以下病理变化中一项或多项：病变肺质地坚实、间质增宽水肿、胸腔脏层和壁层均有纤维素附着、胸腔积液呈黄色或红黄色、肺胸腔黏连。

6.3结果判定

牛、羊出现6.1或6.2的情况，可判定为疑似溶血性曼氏杆菌感染。

确诊应采集有临床症状或病理变化的牛羊鼻拭子、肺脏等组织或无菌采集血清，按实验室诊断方法确诊。

7实验室诊断样品的采集与处理

7.1器材

7.1.1冷冻高速离心机。

7.1.2组织匀浆器或研磨器。

7.1.3手术剪刀和镊子。

7.1.4一次性密封袋。

7.1.55mL冻存管。

7.1.62mL冻存管。

7.1.7采血针。

7.1.8促凝采血管。

7.2试剂

7.2.1TSB培养基（配制方法见附录A中的A.1）。

7.2.20.01mol/LPBS溶液（配制方法见A.2）。

7.2.375%酒精。

7.3病料采集

7.3.1将棉签伸入鼻腔内吸取分泌物，所有拭子采完后分别放入盛有3mLTSB培养基的5mL冻存管

中，编号，记录。采集的样品密封后，采用保温箱加冰密封后运送到实验室。

7.3.2采集新鲜解剖的未破损的牛、羊肺脏，气管注入50mL～100mL灭菌的0.01mol/LPBS溶液,

轻揉肺脏3min～5min,转移5mL～10mL灌洗液分装至2mL灭菌的冻存管中，采用保温箱加冰密封后运送到实验室。

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7.3.3将发病牛、羊剖检后取肺、脾、肝等脏器和淋巴结组织，编号，记录。采集的样品密封后，采

用保温箱加冰密封后运送到实验室。

7.3.4采用75%酒精对待采血动物颈部静脉表面皮肤进行擦拭消毒。用无菌采血针于颈静脉处采血，

立即插入促凝采血管中，充分混匀后编号、记录，采用保温箱运送到实验室。

7.4样品处理

7.4.1将采集鼻拭子中的棉签拧干取出，5000r/min,离心20min。用5mL注射器吸出拭子液上清，

分装到2mL灭菌的冻存管中。贴标签-80℃冰箱保存。

7.4.2将组织样品分解成2×2×3cm大小，将上述组织块，用无菌剪刀剪碎后，加入5mL保存液，

研磨成组织悬液冻融3次或超声波裂解，8000r/min，离心20min。用5mL注射器吸出上清，分装到

2mL灭菌的冻存管中。贴标签-80℃冰箱保存。

7.4.3在4℃下，促凝管5000r/min,离心20min，取血清，分装到2mL灭菌的冻存管中。贴标签-80℃

冰箱保存。

8细菌分离与鉴定

8.1器材

8.1.1高压灭菌锅。

8.1.2恒温培养箱。

8.1.3光学显微镜。

8.1.4生