多克隆抗体制备课件.pptVIP

.*1．抗原的性质，结构简单、分子小、亲缘关系近易诱发免疫耐受；免疫耐受的机制2．抗原的剂量，高剂量的TI抗原可诱导B细胞产生耐受，低剂量与高剂量的TD抗原均可诱导T细胞产生耐受。抗原剂量过低，不足以激活T及B细胞，不能诱导免疫应答，导致低带耐受。抗原剂量过高，抑制性T细胞被活化抑制免疫应答，导致高带耐受。T细胞较B细胞更易于诱导耐受。低带耐受和高带耐受间的比较见下表。免疫耐受的机制3．抗原注射的途径，抗原经鼻内、口服、静脉注射最易诱导耐受，腹腔注射次之，皮下及肌肉注射不易诱导机体产生耐受。口服耐受是指体外给予抗原，通过肠道刺激外周免疫系统产生免疫耐受。4．抗原在体内的持续时间,抗原持续存在刺激免疫耐受，抗原消失免疫耐受逐渐消退。5．抗原不加佐剂易致耐受*。*三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体*目前大部分亲和柱介质都是基于琼脂糖（Agarose）或者葡聚糖(Dextran)。由于琼脂糖稳定性好、对蛋白质的非特异性吸附低、适宜活化，因此是制备抗原亲和柱填料的理想材料。单纯的琼脂糖是不能和蛋白质直接相连的，因此需要给它加一个有活性的臂，这就有点类似多肽与载体蛋白的偶联需要一个双功能试剂一样。琼脂糖加臂（活化)的方法比较多，其中涉及的原理也和多肽与载体蛋白偶联类似，最常用的活化试剂是溴化氰和环氧氯丙烷，另外二溴丙醇、N,N-羰基二咪唑、双环氧化物等也可以用来活化琼脂糖。*.多克隆抗体制备.多克隆抗体的制备方法.动物选择一、选择制备多克隆抗体(抗血清)的动物种类应考虑的要点:需要制备的抗血清的质量;供给蛋白质抗原的动物与免疫动物之间的种系关系;免疫动物产生的抗体特性（针对不同性质的免疫原选用相应的动物）。二、动物的年龄、性别和数量对抗体制备的影响优先选取青壮年动物；雌性动物的免疫应答状况,无论是细胞性还是体液性免疫都比雄性个体强烈。.家兔家兔是最适合制备抗体的动物。其体型适中,成年体重为2～6kg,一次采血量可达25～50ml,全放血量则达100～180ml;性格驯顺,易于操作和采血;寿命相对较长,为5～8年;能生产足够量的高效价和高亲和力的抗血清；通常适用于制备抗啮齿类和人蛋白质的抗体；家兔仅一型IgG而无亚型。用家兔的IgG很容易制备Fc、Fab和F(ab′)2等片段.鸡鸡的种系距哺乳动物较远,用以制备抗哺乳动物蛋白质的抗体具有独特的优点。鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价的Fab或Fab′等片段。鸡可将大量IgY输送入鸡蛋黄中,从鸡蛋中收获抗体可避免采用损伤性的收集手段。.免疫剂量剂量:免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5～1mg/只，小动物约0.1～0.6mg/只。如无免疫佐剂可适当提高免疫剂量（10-20倍）。乳化:一般抗原与免疫佐剂体积比1:1混合。首次免疫采用完全佐剂，加强免疫采用不完全佐剂。（1）延长抗原释放时间；（2）增加抗原的表面积；（3）佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；（4）增强辅助T细胞的作用；（5）刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体。使无免疫原性物质变成有效的免疫原；（6）改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应,并使其增强。.免疫方式注射途径:免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射，一只动物注射总数约为8～10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有利.免疫方式间隔与免疫时间:第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和b细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。免疫次数:根据抗体效价要求确定（抗血清滴度测定）.免疫应答机体免疫系统受到抗原刺激后,免疫细胞发生一系列变化,并产生一定免疫效应的过程。(一)感应阶段(inductivestage)称致敏阶段(sensitizationstage),是抗原物质进入体内,抗原递呈细胞(APC)对其识