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向日葵种子带真菌室内检测技术规程

1范围

本文件规定了向日葵种子携带真菌的室内检测和鉴定技术。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本，适用于本文件不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T2050-2011玉米霜霉病菌检疫检测与鉴定方法

3术语与定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4向日葵种子

用于检测的向日葵种子来自市场上销售的不同向日葵品种。

5向日葵种皮中DNA的提取

5.1种子处理

向日葵种子用2%NaClO溶液浸泡5min，然后将无菌水浸湿的滤纸放置在90mm培养皿中，把去壳的向日葵种子放置在滤纸上，室温放置3h。待向日葵种子吸水膨胀后，取下向日葵种子的种皮，将每4粒种子的种皮放入一个2ml已灭菌的离心管中作为1份样本，用于提取DNA。

5.2种皮中DNA的提取

将收集的向日葵种子的种皮用液氮冷冻后，迅速研磨成白色粉末状，加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取液，65℃水浴30min，每10min振荡1次；随后加入等体积的氯仿-酚-异戊醇（体积比为25∶24∶1）混合液，混匀后静置10min，12000r/min离心后取上清液；加入等体积异丙醇，颠倒混匀，在-20℃中放置30min，12000r/min离心后弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀2次，去除残余液体，晾干后加入20μL无菌水溶解。吸取2μLDNA在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，同时取2μLDNA在NanoDrop2000，上测定其浓度，其余DNA于-20℃保存备用。

6向日葵种子带真菌率的检测与鉴定

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6.1向日葵种子真菌带菌率的检测

种子带菌检测方法参照NY/T2050-2011，每一个向日葵品种随机选择300粒饱满的种子，每100粒种子作为一个重复，共设置3个重复。将种子外壳剥去，取出籽仁，将籽仁放入蒸溜水中浸泡24h，用镊子剥下种皮。种皮用70%乙醇浸泡1min，然后用蒸馏水漂洗两次，每次1min。将种皮放置在灭菌的滤纸上晾干后，放在新鲜制备的MNP-10选择性培养基（附录1）进行培养，培养条件为24±2℃,每皿放置10个种皮。待种皮周围出现菌落后，计数菌落的数量，统计种子带菌率。

种子带菌率按照下面的公式进行计算：

种子带菌率（%）=(带菌的种子数/供试的种子总数)×100

6.2利用PCR验证培养基检测体系的准确性

参照5.1中方法获取向日葵种子的种皮，取4粒种子的种皮放入一个己灭菌的1.5mL的离心管中作为1份样本，置于液氮中用以提取种皮的DNA。采用真菌通用的引物对上述提取的种皮DNA进行PCR扩增。

引物信息：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。

6.3种皮携带真菌的形态学鉴定

将菌落转移到新的PDA培养基上后，利用稀释梯度法进行单孢纯化。对纯化后菌株的菌落形态进

行观察并在显微镜下进行初步的形态学鉴定。

6.4种皮携带真菌的分子生物学鉴定

将在PDA平板培养基上扩繁的真菌的菌落用盖玻片刮下，转入2mL的离心管中，然后采用CTAB方法提取菌株的DNA，利用提取的DNA作为模板进行PCR鉴定，引物采用6.2中的ITS1和ITS4。

取5.0μLPCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测，剩余的PCR产物用于测序分析。PCR产物测序后获得的序列在Genbank进行比对，比对结果中同源性达到99%以上的就可以确定种皮上携带真菌的种名。

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附录A

（规范性）

MNP-10培养基配方

表A.1MNP-10培养基配方（500ml）

配方组成

灭菌方法

Part1

PGA5.0g，NaOH4.0g

121℃,15min

Part2

KNO31.0g，KH2PO41.0g，KCL0.5g，MgSO4.7H2O0.5g，Tergitol0.5ml，琼脂粉15.0g

121℃,15min

Part3

氯霉素25mg，链霉素25mg，金霉素25mg

过滤灭菌

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