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牛副流感3型诊断技术规范

1范围

本文件规定了牛副流感3型的临床症状、病原分离鉴定、RT-PCR、ELISA等实验室诊断技术要求。

本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物疫病诊疗单位对牛副流感病毒3型的检测。

2规范性引用文件

下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

牛副流感病毒3型Bovineparainfluenzavirustype3,BPIV3

牛副流感病毒3型，属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒。该病毒可引起牛以发热、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状为特征的疾病。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）

TAE缓冲液：是由三羟甲基氨基甲烷(Trisbase)、乙酸(aceticacid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的缓冲液

FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）

5流行病学

牛副流感3型一年四季均发，以秋冬、初春季多见。各种年龄牛均可感染。

6临床症状

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病牛以高热、呼吸困难和咳嗽为临床特征。

7实验室诊断

7.1病毒分离方法

7.1.1材料

棉签、胎牛血清（FBS）或新生牛血清（NBS）、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养瓶（板）。

7.1.2仪器

电子天平、研磨仪、低温高速离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养瓶、冰箱。

7.1.3细胞

牛肾细胞（MDBK）和非洲绿猴肾细胞（Vero）。

7.1.4病料采集

7.1.4.1呼吸道拭子

用无菌棉签采取鼻道分泌物，然后放入含1000IU/ml青霉素和1000μg/ml链霉素的DMEM培养基的冻存管中，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。

7.1.4.2血清样品

用促凝管采集新鲜血液，静置分离血清，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。

7.1.4.3组织样品

刚死亡的牛，采集肺组织样品，放入离心管，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。

7.1.5样品处理

7.1.5.1拭子

先经冻融两次，拧干棉拭子，将样品液经6000r/min离心10min，使用一次性注射器吸取上清经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。

7.1.5.2血清

将促凝管中静置分层的血清转移到灭菌离心管，-20℃以下保存备用。

7.1.5.3组织

按照体积比为1:3～1:5加入PBS（pH7.2～7.4），使用组织研磨仪制成匀浆液，取悬液经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃下保存备用。

7.1.6样品接种

取处理过的样品200μl（样品接种量根据细胞数目调整）接种到长满80%的MDBK细胞（25cm2培养瓶），37℃吸附30min；加入含2%FBS或NBS的细胞培养液5ml，同时设对照组，置于37℃,5%CO2的培养箱。

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7.1.7结果判定

逐日观察细胞病变，培养5日后冻融两次，继续盲传，观察细胞病变。BPIV3致细胞病变特点：细胞大量脱落、贴壁细胞变长聚集形成网状。盲传三代后，若出现病变则收获培养物，经反复冻融，以3000r/min离心10min，取上清传代扩繁病毒并进一步鉴定。

7.2RT-PCR

7.2.1材料

移液器及吸头、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、引物（见附录A）

7.2.2仪器

PCR仪、台式冷冻离心机、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。

7.2.3待检样品

处理的样品或细胞培养物。

7.2.4病毒RNA提取

用病毒RNA提取试剂盒对已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品进行RNA提取，并使用核酸分析仪对RNA质量及含量进行测定。

7.2.5RT-PCR反应体系

7.2.5.1RT反应

20μL体系：下游引物1μl，dNTPMixture1μl，模板RNA2μl，RNaseFreedH2O6μl。65℃保温5min后，冰上迅速冷却。在上