多重呼吸道液相芯片检测方法的应用.docx

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多重呼吸道液相芯片检测方法的应用

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摘要

呼吸道感染为临床最为常见的疾病，其引起的原因是多样的，含有细菌、病毒与支原体等，其临床的表现同治疗因病院不同也具有较大的差异。相关研究显示，90%以上的呼吸道疾病与大部分的下呼吸道疾病都是细菌的病原引起的，其中含有呼吸道病毒最为常见。

常见的呼吸道病毒具有较强的感染力、传播速度较为快速，同时新致病性病毒还是在不断的产生。依据医疗部门统计，呼吸道与胞病毒为呼吸道感染中最为常见的病原体，占据病毒感染总额的85%以上，同时具有7%的致死率，对于公共健康具有严重的威胁。所以构建一种快速准确的诊断模式，不仅仅有助于病因确诊，也有助于临床的针对治疗。

关键词：呼吸道感染；支原体；致病性病毒

引言

液相芯片是上个世纪90年代有欧美开发出来的新一代分子检测技术，这一平台将流式检测技术同芯片技术有机的结合，具有高通量、高速度以及高灵敏度等特征，被国内外的专业认为是评价临床诊断的关键技术。其可以在不同荧光编码的微型球上开展抗原与抗体免疫检测，通过两束激光分别得检测微球编码与荧光信号进而达到多指标定量分析的目标。其含有的最大优势在于通过1次检测，就可以分析100多个指标，可以自由灵活的对于各种指标开展联合的检测。

这种检测技术一致被欧美等国家占有，所以实现液相芯片技术的国产化与具体应用意义重大，为此本文将分析山东立菲生物有限公司开发的全自动液相芯片分析系统，分析其具体的应用。最后得到一种快速准确检测多重病院体检测的方法，为呼吸道病原体感染性疾病的快速诊断提供了大力的支撑。

1.材料与方法介绍

1.1材料试剂介绍

本文具体选择常见的呼吸道合胞体病毒、流感病毒AB型病毒以及副流感病毒等作为本文具体的研究对象，所含有的阳性对照病毒以及VEVRO、MDCK等宿主细胞株都是通过良好的环境保存；本次试样的试剂为病毒RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂检测装置，链合青霉素标记的藻红蛋白以及全自动相芯片分析系统，来自于山东立菲生物产业有限公司。本次试验检测的全部标本来自于医院疑似呼吸道病毒感染咽拭子，收集并保存在-80℃的环境中。

1.2方法介绍

首先为寡聚核苷酸探针的设计与制作，依赖于GENEBANK内部呼吸道合包病毒、流感病毒以及几种亚型的副流感病毒核苷酸序列，通过Bioedit等生物学软件对于核酸序列开展对比之后，针对于保守模块开展PCR引导以及探针的制作，其中对于上下游的引物5’采用为为掺入不同的接头序列用于开展第二轮的PCR。

其次为对于病毒培养以及核酸的提取，呼吸道合胞体病毒感染的VEVRO以及流感病毒、副流感病毒感染的MDC等，3天之后开始收集相关细胞，之后在通过RNA试剂盒提取总的RNA，作为病毒的RNA阳性对照依据。

最后对于待检测病毒核酸的扩增与标记活动，本文通过总RNA作为模块，通过含有通用的接头特异性引物开展一步法的体外转录以及扩增，进而得到cDNA。本文以cDNA作为模块，通过含有生物素开展标记，其与通用接头序列反相的互补，开展引物的第二轮PCR扩增，之后将生物素引入到PCR产物内部。最后本文将第二轮的PCR掺入引进到偶联探针与特定的编号微球内部，保持的环境温度为10min95℃以及15min54℃，之后在经过SAPE5ul温度在54℃10min。等待反应结束之后上机检测，如果检测的结果平均荧光数值低于100的时候是阴性，如果高于100的时候为阳性。

2.检测结果分析

针对于医院疑似呼吸道病毒感染的咽拭子，得到的4种实验室培养的病毒阳性对照检测结果如图2.1所示：

图2.1多重PCR检测呼吸道病毒咽试纸样本和阳性对照图

针对于X轴表示为待测样本以及4种病毒含有的阳性对照以及空白对照，Y轴表示的为四种病毒的检测探针，Z轴表示的系统检测得到100次具有的平均荧光数值。图中具有的阴性信号最大数值为83，阳性信号的最低数值为248。通过本次的检测结果显示，阳性对照病毒的信号都是在2000以上，但是阴性的对照信号都是在100之下，为此针对于检测结果的阴阳开展判断的阀值可以设定为100，同时针对于样本内部都没有检测得到流感病毒B型以及副流感病毒。同时对于6例样本都是检测得到了呼吸道合胞体病毒以及流感病毒A型，2例样本内部检测得到流感病毒A型，这就提示呼吸道合胞体病毒以及流感病毒A型为呼吸道病毒内部比较常见的，同时二者共同感染是普遍存在的。另外真毒与上面样本的PCR片段开展Sanger的检测，其结果同Luminex结果类似，所以进一步的得出本文设计研究的多重病原体检测技术是灵活与可靠地，具有较大的应用性。

3.分析与讨论

如今病原体的检测模式主要含有病原体分离培养、核酸检测以及免疫学检测等。在其内部病原体分离耗时